膈下逐瘀汤加减方对气滞血瘀型输卵管炎大鼠模型TNF-α蛋白表达的影响

李 月，陈 培，刘 丽

（黑龙江中医药大学，哈尔滨 150040）

目前，不孕症的发生率在我国为7%～10% 。而不孕原因中盆腔因素则占35%，其中以慢性输卵管炎导致的不孕症较为常见[1]。在治疗方法上西医则用抗生素、输卵管通液术、宫腔镜、腹腔镜等治疗，存在易反复发作，且创伤性较大等不良反应；而中医药治疗则毒副作用较小，创伤性较小并且能有效减轻临床症状。近年来，在临床上应用膈下逐瘀汤加减方治疗气滞血瘀型输卵管炎取得了较好疗效。本研究应用雌性大鼠建立气滞血瘀型输卵管炎性模型，在造模成功后第29天同时分组给予膈下逐瘀加减方和康妇炎胶囊治疗比较其对TNF-α蛋白的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8～12 周龄健康性成熟雌性 Wistar

大鼠48只，体质量平均为200 g ，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK（京）

2016-0001。标准环境（室温19～24 ℃），标准大鼠饲料喂养，自由饮水，予以每日早8: 00到晚8: 00人工灯光照明。大鼠饲养房每日1次紫外线灯消毒 。

1.1.2 试验药品与试剂 膈下逐瘀颗粒药物组成：牡丹皮15 g，赤芍20 g，延胡索 20 g，桃仁 15 g，鳖甲15 g，乌药15 g，川芎15 g，香附20 g，枳壳15 g，地龙15 g（由黑龙江中医药大学附属第一医院药剂科提供）。康妇炎胶囊，山东步长神州制药有限公司，批号：150530。

1.1.3 实验菌种 4 × 109金黄色葡萄球菌悬液0.1 mL，菌号为 FSCC223005；10%水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司，批号：20160709。

1.1.4 实验仪器 TNF-α试剂盒（购自武汉博士德生物工程有限公司）；JTC-1 型惊觉及痛觉实验交流刺激仪（成都仪器厂）；UC4-75 电铃（白云电子器材厂）。

1.2 方法 经适应性喂养7 d后，将48 只Wistar雌性大鼠随机分为4组，每组12只，分别为正常组、模型组（气滞血瘀型输卵管炎组）、成药组（康妇炎胶囊组）、中药组（膈下逐瘀汤加减方组）。造模前用电子称称重，随即编号，正常对照组予以正常喂养，连续4周；模型组10%水合氯醛按0.4 mL/100 g经腹腔注射麻醉后，将大鼠卧式平放，两侧脊柱术区剃毛，然后碘伏消毒，取肋缘过肾区0.5 mL近脊柱侧旁开 1 cm 行横切口。打开腹腔，拨开其他组织，暴露输卵管，然后将4 × 109金黄色葡萄球菌悬液 0.1 mL 注射到输卵管后，逐层缝合肌层、皮层。手术完毕后再次进行皮肤消毒，然后另一侧输卵管同样方法操作，术毕放于鼠笼内，等待苏醒之后给予正常饲养，共 4周；1周给予声光电刺激：比如大鼠足底 24～35 V 电击刺激，噪声刺激（等级为3级），频率为 1～3 kHz 强度的闪烁光刺激，以上刺激每8～15 min 1次；夹尾：用长镊夹大鼠鼠尾，使其与其他大鼠撕打（撕打时可松开镊子），1次/h，倾斜鼠笼2 h，1次/d[2]，连续3周；造模后第29天开始灌胃给药，成药组为康妇炎胶囊悬液0.064 g/kg，灌胃体积为1 mL/100 g，连续灌胃28 d，中药组为膈下逐瘀汤加减方0.064 g/kg，灌胃体积为1 mL/100 g，连续灌胃28 d。

1.3 测定指标

1.3.1 大鼠行为及宏观体征观察 观察造模期间和造模后各组大鼠的活动情况、精神状态、皮毛、色泽、舌质、大小便和饮食情况等。

1.3.2 血清TNF-α水平测定 于第29天，术前做好相关准备，每组随机选取10只大鼠，水合氯醛（10%，3 mL/kg）麻醉大鼠后，分离腹主动脉，经腹主动脉取血后，取输卵管用于TNF-α蛋白表达测定。依照ELISA 试剂盒操作规程测定 TNF-α蛋白水平。

1.3.3 组织病理学观察 进行输卵管标本的采集，肉眼观察组织形态变化后，在10%中性甲醛溶液中固定，常规切片染色后，观察输卵管有无病理改变及改变程度的轻重。

1.4 统计学方法 采用 SPSS 20.0统计软件进行数据分析，多组间比较用方差分析，计数资料比较使用χ2检验，等级资料分析用秩和检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为及宏观体征变化比较 模型组与正常组相比，模型组大鼠出现爪、尾、舌从红到紫的转变、活动量减少、精神异常、呼吸减少、攻击性增强、进食减少、粪便不成形、体质量增长缓慢等现象。

2.2 各组大鼠组织病理学变化比较 模型组与正常组相比输卵管有病理改变及改变程度不同：模型组出现血管壁充血肿胀，管壁增厚，变硬，管腔阻塞不通，管体增粗，输卵管常与卵巢黏连，输卵管的伞端部分有部分或者完全的阻塞，闭锁，黏膜皱襞向内卷曲，管腔与盆腔黏连程度重。

2.3 各组大鼠血清 TNF-α水平变化比较 与正常组相比较，模型组TNF-α蛋白表达强度差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，中药组和成药组TNF-α表达强度有显著差异，具有统计学意义（P＜0.05）。同成药组比较，中药组TNF-α表达差异有统计学意义（P＜0.05）。膈下逐瘀汤加减方抑制输卵管上皮TNF-α蛋白表达强度优于成药康妇炎胶囊。见表1。

表1 各组大鼠血清TNF-α水平变化比较（n = 6）

3 讨论

由于社会医疗保障体系及法律保障体系的缺失，临床试验机构和临床试验的申办方沦为临床试验中的弱势群体。如若能做好相关病证结合的动物模型，即可在动物身上做实验，然后应用于临床，既能促进该疾病的进一步研究，同时也能保障临床试验机购的相关权益[3]。故为进一步探讨气滞血瘀型输卵管炎的作用机制，可应用大鼠造出气滞血瘀型输卵管炎模型，虽然灵长类动物基因组与人类相似度较高，但其价格昂贵，物种稀有，实验周期长，饲养条件高，故灵长类动物模型的使用受到限制，所以使用大鼠作为实验对象[4]，即用金黄色葡萄球菌注射到输卵管后造成输卵管炎症模型[5]，慢性输卵管炎性模型成功后再此基础上进行声、光、电、夹尾的刺激，大鼠长期情志不舒，气机不畅，无力推动血行，日久发展为血瘀，遂建成气滞血瘀的模型[6]。输卵管炎症模型的成功建立再结合气滞血瘀的模型，建立与证候相一致的动物模型。这种病证结合造模的方法，既在西医病理造模的基础上叠加中医证候[7]。病证结合模型既有西医明确的指标评价支持，又引入中医的辨证思想。这更符合临床诊治的情况，更有利于探讨疾病的病理变化在中医特定证型中的表现，同时也方便用于西医评价标准进行评估。从而可以更好的研究疾病的发病机制并找到有效的治疗方法。输卵管炎性不孕，归属于中医学妇人腹痛、不孕、断绪等病证范畴。主要病机为瘀血阻滞，脉络不通，临床以气滞血瘀型多见，治疗上多重视理气活血，化瘀止痛[8-10]。膈下逐瘀汤出自清代王清任《医林改错》，主治血瘀引起的一系列病证[11]。近年来随着对该方剂的不断研究，发现其在输卵管炎性治疗方面有着显著疗效。如王忠[12]用膈下逐瘀汤治疗输卵管不通患者12例，总有效率80.0 %；赵丽燕[13]用输卵管通液术联合膈下逐瘀冲剂治疗并与单纯输卵管通液术相比较，前者疗效显著。现代药理学研究证明，方中赤芍、牡丹皮、桃仁，乌药、川芎、枳壳、香附，鳖甲、地龙等，具有改善末梢循环的作用，使局部血供改善，有利于黏连组织的消散与吸收。本实验结果表明，膈下逐瘀汤加减方能抑制输卵管上皮TNF-α蛋白的表达，强度优于成药康妇炎胶囊。TNF-α是炎症反应程度的重要指标，主要由单核细胞和巨噬细胞产生，在正常输卵管以及炎性输卵管黏膜上皮细胞上均有表达[14]，具有抗肿瘤机制、免疫调节作用，在炎症反应的调节中起着重要作用，同时观察发现大鼠腹腔黏连的程度越重，TNF-α的值会升高，而TNF-α产生减少，机体清除生殖道病原体的能力降低。如武孟香等[15]采用免疫组化法也发现 在正常输卵管和炎症输卵管上均有TNF-α表达，但正常输卵管黏膜上皮细胞的表达较低，炎症输卵管黏膜上皮细胞的表达显著高于正常输卵管组织。从而证明膈下逐瘀汤加减方通过对TNF-α的调节参与炎症的愈合过程的结论，为输卵管炎性不孕的发病机制与治疗提供了理论依据。