红霉素耐药粪肠球菌生物膜特点分析

魏影 郭妍 柏柳 陈艳丽 黄嵘赫 余治健 邓启文 李桂秋

肠球菌是人和动物肠道内重要的正常菌群，近年肠球茵属细菌引发的感染不断增加，粪肠球菌已成为医院内感染的重要病原菌之一[1-4]。生物膜形成是细菌耐药的重要原因之一，生物膜形成也是粪肠球菌的重要特点，以往我们的研究表明其阳性率超过50%，即使是一些非耐药的肠球菌也能形成难以根除的生物膜。近年红霉素耐药粪肠球菌已经成为较高的比例，红霉素耐药粪肠球菌在我国主要有erm基因介导耐药传播，多种G+细菌已经报道红霉素耐药株具有克隆聚集性和不同的耐药特点，然而红霉素耐药粪肠球菌的分子特点和生物膜形成特点仍无报道。多个毒性因素与粪肠球菌生物膜的形成有关，粪肠肠球菌的毒力因子有聚类物质、表面蛋白、细胞溶解素、明胶酶E、透明质酸酶、信息素诱导蛋白、胶原结合蛋白、心内膜炎抗原及信息素等[5-8]。红霉素耐药粪肠球菌中这些毒力因子的分布尚不清楚。因此，本实验主要探讨红霉素耐药粪肠球菌生物膜形成特点与毒力基因和耐药基因特点之间的关系，分析该类细菌生物膜形成特点。

1 材料和方法

1.1 材料

收集251株自深圳市南山医院2010年1月—2017年6月分离自患者标本的粪肠球菌，质控菌株是粪肠球菌菌株ATCC29212和OG1RF （ATCC47077）。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定和药敏试验 采用BD Phoenix-100全自动细菌鉴定/药敏系统进行药敏试验，主要药物包括阿米卡星（丁胺卡那霉素）、氨苄西林、苯唑西林、复方磺胺、红霉素、环丙沙星、甲氧苄胺嘧啶、利福平、利奈唑胺、青霉素、庆大霉素、四环素、替考拉宁、头孢西丁、万古霉素、呋喃妥因。采用2017年版美国临床和实验标准化协会（CLSI）推荐的微量肉汤稀释法再次确认红霉素耐药标准，以粪肠球菌ATCC29212作为质控菌株。红霉素敏感、中介和耐药的MIC值定义为MIC≤0.5 mg/L、MIC 1～4 mg/L 和 MIC ≥ 8 mg/L。

1.2.2 毒力基因的检测 毒力基因引物由北京六合华大基因公司合成[9-10]。按试剂盒说明提取菌株基因组DNA，-20 ℃保存备用。采用PCR检测毒力基因。PCR体系（50 μl）：Dream Taq Green PCR Master Mix（2×） 25 μl，上、下游引物各 1 μl，DNA 2 μl，加dd H2O补至50 μl。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共30个循环；72 ℃ 10 min，PCR产物于4 ℃保存。PCR反应产物均用1%的琼脂糖凝胶电泳，根据有无阳性扩增产物及目的基因片段长度进行判断分析。

1.2.3 生物膜检测及判读 根据参考方法，对生物膜的形成进行了检测[4]。对在TSB培养基中过夜生长的细菌；稀释200与TSBG培养基中，其中有0.5%的葡萄糖；每孔200ul加样到96孔聚苯乙烯微板上，每个菌株3个复孔；37摄氏度的情况下静态孵化24小时；吸干孔子菌液并用PBS清洗3次，用甲醇固定15分钟后吸干，用0.5%的结晶紫染色10分钟后吸干，再用蒸馏水冲洗；最后加入4：1无水乙醇和丙酮的汇合溶液，混合均匀后在OD570光度下检测。每一项试验至少进行三次。生物膜OD值的判读在染色后的96个微孔读数从0.05到3.5不等。生物膜表型分类基于他人的方法，强阳性（OD570＞2），中等（OD570，1～2），或弱（OD570＞0.5和OD570＜1）。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 18.0软件完成。计量资料两组间比较采用t检验，计数资料比较采用χ2检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 红霉素耐药粪肠球菌生物膜的形成特点

在结晶紫染色后的96孔板读数从0.04到3.5。生物膜表型分类基于他人的方法分为（OD570＞2），中等（OD570，1～2），或弱（OD570＞0.5和＜1）[4-5]。OG1RF控制菌株（弱生物膜）和ATCC29212菌株OD570的中值分别为0.95和0.22。在所有被检测的粪肠球菌分离菌株中，有超过一半的粪肠生物膜表现为弱阳性及以上，在这些生物膜形成的菌株中，弱生物膜表型、中等生物膜表型和强生物膜表型中菌株数相差不大。利用肉汤稀释法测定了红霉素的MIC值，并对MIC 8 μg/mL的抗性标准进行了分类，发现192株含有红霉素抗性的菌株；红霉素敏感、中介和耐药的粪肠球菌生物膜形成的流行率为71.4%（5/7）、51.9%（27/52）和58.9%（113/192）（见表1）。值得注意的是强生物膜形成比例在红霉素耐药和中介菌株中高于红霉素敏感组（19.8% vs.13.5%vs.0），中介组和耐药组强生物膜形成比例差异无统计学意义。

2.2 红霉素耐药粪肠球菌生物膜形成与红霉素耐药基因之间的联系

PCR检测结果提示红霉素耐药粪肠球菌的耐药基因ermA、ermB和ermC阳性检出率分别为1/192、155/192和1/192；ermA和ermC各自检测到一株阳性株，生物膜分别为强阳性和阳性，但阳性基因菌株数量太少，ermA和ermC耐药基因与生物膜形成之间关系仍有待进一步研究。ermB基因与生物膜形成相关性经统计学分析无显著相关性（P＞0.05）（见表2）。

2.3 生物膜形成与毒力基因间的相关性

表3所示，192株粪肠球菌红霉素耐药的菌株，对PCR扩增毒性基因的分析表明，esp、asal 和cylA阳性粪肠球菌分离菌株比其相对应的阴性分离株的生物膜形成率显著提高。此外，生物膜的形成与esp和cylA毒力基因有关。

3 讨论

本研究结果提示粪肠球菌生物膜形成阳性率为57.8%，低于欧洲先前报道的60%～90%的流行率[5-8]。特别是在这项研究中，从胆汁中分离出来的粪肠球菌生物膜的流行率为36.4%，比由尿液和血液分离出来的生物膜阳性率低了超过20.0%，我们的生物膜阳性率与其他地区报道的不一致可能与地区差异有关。本研究结果提示红霉素耐药粪肠球菌的阳性率（58.9%）与红霉素中介组差异无统计学意义，但高于红霉素敏感组，可能与红霉素敏感菌株入组例数太少有关，红霉素敏感组的粪肠球菌生物膜形成比例有待进一步研究。总体而言，红霉素耐药粪肠球菌生物膜阳性在粪肠球菌中并没有显著偏高，但强阳性的菌株在红霉素耐药组和中介组比例高于敏感组需要引起注意。

粪肠球菌生物膜形成和抗生素耐药关系的研究报道较多。近年报道提示利奈唑胺耐药株生物膜形成比例显著升高，耐药株中强生物膜形成菌株显著高于利奈唑胺敏感菌株组。红霉素耐药基因的检测中发现，粪肠球菌主要携带ermB基因，ermA、 ermB和ermC基因与生物膜的形成没有相关性。

本研究发现红霉素耐药粪肠球菌中esp+分离株更有可能表现出强或中等的生物膜形成，这与之前的几项研究一致，这些研究表明该毒力基因和粪肠球菌生物膜形成之间联系[9-10]。本研究提示hyl基因和gelE基因与粪肠球强或中生物膜形成成反比；这与先前的研究结果，能够水解明胶、胶原蛋白和血红蛋白的gelE可能有利于粪肠球菌生物膜的发展不一样；但也有另一些研究则发现，在粪肠球菌中，gelE的存在与生物膜的形成没有显著的相关性。此为本实验中还发现了cylA与粪肠球菌生物膜的形成成正比；此前有报道称，CylA与尿道分离的粪肠球菌生物膜形成有关。因此红霉素耐药粪肠球菌中CylA基因和Esp基因与生物膜形成密切相关[11-13]。

表1 红霉素敏感性与生物膜形成之间的关系分析

表2 红霉素耐药粪肠球菌生物膜形成与耐药基因之间的关系

表3 红霉素耐药粪肠球菌生物膜形成与毒力基因之间关系

总之，目前的研究表明红霉素耐药粪肠球菌容易形成生物膜，耐药组生物膜形成阳性率与红霉素中介组比较差异无统计学意义。红霉素耐药粪肠球菌生物膜形成能力与ermB基因无显著相关性。esp、gelE和cylA与红霉素耐药粪肠球菌生物膜形成显著性相关。