植物乳杆菌DMDL9010冻干优化研究

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广州510640；2.广东燕塘乳业股份有限公司，广州510640）

0 引言

随着研究人员对乳酸菌的不断研究，乳酸菌类产品的应用越来越广泛[1]。植物乳杆菌作为白菜、甘蓝、黄瓜等蔬菜发酵的主要微生物之一[2]，具有降低胆固醇、调节血脂、控制体质量等益生保健功效[3]。目前，乳酸菌制剂采用真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等不同的方法进行制备[4-8]，其中冷冻干燥是生产乳酸菌发酵剂常使用的工艺，但是冻干过程中会导致细胞活力降低。陈涛等[9]研究发现在冻干过程中影响菌粉存活率的因素有很多，研究如何提高存活率具有重要意义[10-11]。

笔者课题组前期从泡菜水中筛选出得到具有较好的降胆固醇效果的植物乳杆菌DMDL9010(Lactobacillus plantarum DMDL9010)，对其离心条件和冻干保护剂进行优化，以期为提高菌粉冻干存活率及开发商品化蔬菜发酵专用乳酸菌剂提供理论基础。

1.1 菌种、培养基和保护剂

植物乳杆菌 DMDL9010（Lactobacillus plantarum DMDL9010），由华南理工大学食品科学与工程学院食品质量与安全系筛选分离并保存。

MRS培养基，在 0.10-0.15 MPa，121℃灭菌 15 min；脱脂乳粉、葡萄糖、海藻糖、甘氨酸、可溶性淀粉、抗坏血酸、硫酸锰均为分析纯。

1.2 仪器与设备

冷冻干燥机（SCIENTZ-18N），高速离心机（JW-3021HR），立式压力蒸汽灭菌器（YXQ-LS-18SI）。

1.4 方法

1.4.1 菌种活化

将植物乳杆菌DMDL9010按照体积分数为3%的接种量，接种至基础MRS培养基中，活化菌株。

1.4.2 离心条件的优化

在离心转速分别为4 000，6 000，8 000，10 000 r/min、的条件下，将活化好的菌悬液，分别进行10，20，30 min

1 实 验

离心，收集上清液与菌泥，稀释平板计数[12]，比较在不同参数下菌株的离心存活率[13]。

1.4.3 单一保护剂的筛选

选取脱脂乳粉（质量分数，下同，3%，6%，9%，12%，15%），葡萄糖（2%，4%，6%，8%，10%），细菌学蛋白胨（2%，4%，6%，8%，10%），可溶性淀粉（10%，12%，14%，16%，18%，20%），甘氨酸（3%，6%，9%，12%），甘油（1.0%，1.2%，1.4%，1.6%，1.8%，2.0%），海藻糖（10%，12%，14%，16%，18%）作为单一冻干保护剂，以单体菌粉活菌数（g-1）[14]为依据，研究其在冻干过程中对植物乳杆菌DMDL9010的保护效果。其中，菌泥与配制的冻干保护剂溶液体积为1∶3。

1.4.4 Box-Behnken 优化实验设计

将单因素筛选出的保护效果较好的冻干保护剂脱脂乳粉、海藻糖和细菌学蛋白胨做为实验因素，以植物乳杆菌粉活菌数为响应值，设计Box-Behnken响应面分析实验。采用Design Expert 8.0.5软件辅助实验，实验因素水平及编码见表1，实验设计及结果见表4。并重复优化实验保护剂组合，对实验结果进行验证。

表1 Box-Behnken设计因素水平 %

1.5 数据统计分析

采用Design Expert 8.0软件完成响应面设计、数据分析、回归模型建立，Origin Pro 8.0进行作图。试验数据采用SPSS19.0软件进行数据分析。每组实验测定3个数据，数据用M±SD表示。

2 结果分析

2.1 离心条件的优化分析

表2 离心实验结果

由表2可以看出，相同离心时间下，随转速的升高，上清液活菌数显著降低，菌泥活菌数先升高后降低，且在转速为8 000 r/min时达到最大活菌数，这表明过低的离心转速使得菌体无法充分沉淀，获得菌泥量少，而过高的离心转速虽能有效使菌体沉淀，但对活菌机械损伤程度大，大量活菌在离心过程中受到损伤、死亡。相同转速下，随离心时间的延长，上清液活菌数明显降低，菌泥活菌数明显增加，且在离心30 min时活菌数达到最大，表明足够的离心时间可以使活菌充分沉淀。但离心时间不宜过长，过长的离心时间会使效率降低，不利于大规模生产。这与王大欣[15]等的研究结果一致，在保证较高的活菌数量的前提前选择最优的离心条件。

选取8 000 r/min（30 min）的离心参数，以保证最佳的离心存活率，此时菌泥活菌数可达最大值31.35×108mL-1。

2.2 单一冻干保护剂筛选

表3 不同冻干保护剂对植物乳杆菌DMDL9010的影响 g-1

由表3可知，当菌泥中加入6.0%的脱脂乳粉时，冻干后菌株存活率可达43.16%，与杨加怀[16]的研究结果一致，脱脂乳粉对植物乳杆菌DMDL9010具有显著的保护作用。脱脂乳粉是良好的有机氮源、碳源，且脱脂乳粉中含有的乳清蛋白在冷冻干燥的过程中对植物乳杆菌DMDL9010有一定的保护作用[17-18]。

当葡萄糖质量分数低于8.0%时，随着葡萄糖质量分数的增加，冻干后菌株存活率明显提高，高于8.0%时，存活率显著降低，即当菌泥中加入8.0%葡萄糖时，冻干后菌株存活率可达到最大16.14%。葡萄糖可以促进细胞在悬浮液中分散，还可以作为细胞今后生长用的碳源[19]。但与其他的备选保护剂相比，葡萄糖对植物乳杆菌DMDL9010的保护作用要低于脱脂乳粉、海藻糖和细菌学蛋白胨，这与张英华等[17]的研究一致。

细菌学蛋白胨质量分数为8.0%时，菌株存活率最高30.24%，但细菌学蛋白胨质量分数低于或高于8.0%时，存活率显著降低，且保护剂含量增高易出现冻干不彻底现象，影响冻干菌粉的品质。

在一定的质量分数范围内，随着可溶性淀粉质量分数的增加，冻干后菌株存活率提高。但可溶性淀粉质量分数高于16.0%时，存活率呈明显下降的趋势，即当菌泥中加入16.0%的可溶性淀粉时，存活率最高仅为4.75%。这与张泽生等[18]的研究一致，加入可溶性淀粉后，植物乳杆菌的存活率较低。

甘氨酸对于植物乳杆菌DMDL9010的保护作用比较有限。随着甘氨酸质量分数的增加，冻干后菌株存活率显著降低。甘氨酸的在生理盐水中的溶解度较低，且与其他备选保护剂相比，所冻干后活菌数较低，获得甘氨酸的成本较高，工业上的应用可行性不足，因此，不宜选择甘氨酸作为后续优化的冻干保护剂。

甘油质量分数为1.8%时，冻干后菌株存活率最高3.64%。甘油属低分子中性物质，在溶液中易结合水分子，发生水合作用，使溶液的黏度增加，从而弱化了水的结晶过程，减轻了细胞外溶质质量分数升高所造成的细胞损伤。同时，甘油进入细胞后，使细胞内溶质质量分数升高，细胞内压力接近于细胞外压力，减少了细胞脱水的程度和速度[20]。当甘油质量分数达到2.0%以上时不易冻干，所制成的菌粉较黏稠，无法研磨成粉末状。

海藻糖具有抗冻抗热的稳定性。海藻糖不仅可以通过与细胞外水分子形成氢键来提高细胞内蛋白质的稳定性[21]，而且它具有较高的晶体转换温度，可以在较高的冻干温度下保持很好的稳定性[22]。，当菌泥中加入14.0%海藻糖时，冻干后菌株存活率最高，达28.68%。这与王大欣[15]等的研究结果相一致，在众多的保护剂中，海藻糖保护效果显著。

综上所述，添加脱脂乳粉6.0%，细菌学蛋白胨8.0%，海藻糖14.0%时菌株存活率最高，对植物乳杆菌DMDL9010冻干的保护效果较好。这与张英华等[17]的研究一致，张英华等的实验结果表明，脱脂乳粉、细菌学蛋白胨、海藻糖对乳酸菌的保护作用要优于其他冻干保护剂。

2.3 Box-Behnken实验结果

在单因素实验基础上，以植物乳杆菌粉活菌数为单一指标，选择脱脂乳粉、海藻糖和细菌学蛋白胨作为3个实验因素做Box-Behnken设计，设计及结果如表4所示。

表4 Box-Behnken设计及结果

利用DesignExpert8.0软件对上述数据进行分析，得回归模型方差分析，结果见表5。

表5 Box-Behnken回归模型的方差分析结果

对表5回归模型方差分析，实验所选用模型P值0.0002＜0.05，决定系数R2=0.9696，说明模型与实际情况拟合良好。根据以上分析得知活菌数Y对自变量脱脂乳粉（A）、细菌学蛋白胨（B）、海藻糖（C）的多元回归方程：

该方程表达了植物乳杆菌DMDL9010菌粉活菌数和3个自变量之间的线性关系是显著的，同时实验方法也是可靠的。回归方程的一次项系数比较大，交互项系数中BC的交互系数比较大，说明细菌学蛋白胨和海藻糖之间的交互效应大，而AB、AC的交互系数比较小，说明脱脂乳粉和细菌学蛋白胨、脱脂乳粉和海藻糖之间的交互效应小。

为了检验方程的有效性，对测定的植物乳杆菌DMDL9010菌粉活菌数的数学模型进行方差分析，并对各因子的偏回归系数进行检测。一次项中A的回归系数高度显著，P＜0.0001说明脱脂乳粉质量分数对植物乳杆菌DMDL9010生长有高度显著作用。C的回归系数仅次于A，说明不同质量分数对植物乳杆菌DMDL9010生长影响仅次于脱脂乳粉。交互项BC回归系数较其他因素显著，说明细菌学蛋白胨和海藻糖之间的交互项对植物乳杆菌DMDL9010的生长较为显著。拟合度R2=0.9696，说明该方程对实验拟合度良好。

根据回归方程作出不同因子的响应面分析图及等高线图（图1），分析脱脂乳粉（A）、细菌学蛋白胨（B）、海藻糖（C）的不同质量分数组合对冻干后植物乳杆菌DMDL9010菌粉活菌数的影响。

图1 Box-Behnken优化实验拟合响应曲面交互作用影响

为了得到植物乳杆菌DMDL9010菌粉最大活菌数，培养基中脱脂乳粉和海藻糖水平需要比例适宜。由图1和方差分析可知，对植物乳杆菌DMDL9010菌粉活菌数的影响顺序为BC＞AB＞AC。

对二次回归方程求一阶偏导，当响应值Y（冻干菌粉活菌数）最大值时各因子水平为脱脂乳粉（A）12.00%、细菌学蛋白胨（B）7.95%、海藻糖（C）15.20%。此时理论预测植物乳杆菌DMDL9010菌粉活菌数为4.195×108g-1，其中冻干存活率达13.38%。

2.4 验证实验

为验证Box-Behnken实验结果的可靠性，重复优化实验冻干保护剂组合（脱脂乳粉12.00%，细菌学蛋白胨7.95%，海藻糖15.20%）。结果表明，植物乳杆菌DMDL9010菌粉活菌数可达3.78×108g-1，与理论预测值相吻合。

3 结 论

本文探究了植物乳杆菌DMDL9010冻干优化的方法，应用离心法收集菌泥，探究不同离心速率及时间对菌体活菌率的影响，最终确定了最佳离心条件为8 000r/min（30 min），此时菌泥活菌数可达最大值3.135×108mL-1，但离心转速与时间参数过大，有待于进一步探讨；通过单因素筛选和响应面优化，实验数据得到的二次响应曲面模型具有较高的回归率，与实验结果吻合程度较高，确定了脱脂乳粉12.0%，细菌学蛋白胨7.95%，海藻糖15.2%时为最佳保护剂配方，此时理论预测植物乳杆菌DMDL9010菌粉活菌数为 4.195×108g-1，进一步进行验证试验，测得实际菌体数为3.78×108g-1，即冻干后菌体活力高，冻干存活率达13.38%，为开发商品化蔬菜发酵专用乳酸菌剂提供理论基础。此冻干保护剂配方成分简单，价格低廉，可为其他微生物或动植物细胞保护提供参考。