生鲜牛乳中三种β-内酰胺酶检测方法的比较

张磊，王利刚，付莎莉，吴丹，陈欣，苏敏，黄思瑜，杨小珊

（重庆市食品药品检验检测研究院，重庆401121）

0 引言

在奶牛饲养中使用β-内酰胺环类抗生素可导致生产的生鲜牛乳中含有抗生素残留，国际和国内均规定生鲜乳中抗生素“不得检出”[1]。2009年，全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治领导小组发布《食品中可能违法添加的非食用物质名单(第二批)》，将β-内酰胺酶（金玉兰酶制剂）列入乳与乳制品中可能违法添加的非食用物质，生鲜牛乳中添加β-内酰胺酶的现象得以改善[2]，但仍有生鲜乳中检出β-内酰胺酶的报道[3-8]。

目前，检验中用到的β-内酰胺酶的检测方法有碘量法[9]、酸度法[10]、高效液相色谱法[11]、免疫法[12]、微生物法（杯碟法）等[13]。本研究将杯碟法、碘量法和基于免疫法的快速检测条法三种实验室常用检验方法进行了比较和讨论，为实验室β-内酰胺酶的检验工作提供参考。

1 实验

1.1 仪器与试剂

恒温培养箱，高压灭菌锅，牛津杯，麦氏比浊仪，Charm ROSA 56C孵育器，Charm ROSA读数仪。

藤黄微球菌(Micrococcus luteus)CMCC(B)28001，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，营养琼脂，抗生素检测用培养基Ⅱ，Charm MRLβ-内酰胺酶快速检测条，浓度为0.1 mol/L碘标液，脱脂奶粉。

青霉素标准品，β-内酰胺酶标准品，舒巴坦标准品。

1.2 试剂配制

磷酸盐缓冲溶液（pH=6.0）：无水KH2PO4为8.0 g，无水K2HPO4为2.0 g，蒸馏水加至1 000 mL，121℃灭菌15 min。

青霉素标准溶液：称取适量青霉素标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为0.1 mg/mL的标准溶液，现配现用。

β-内酰胺酶标准溶液：量取β-内酰胺酶标准物质，用磷酸盐缓冲溶液稀释至所需浓度，现配现用。

舒巴坦标准溶液：称取适量舒巴坦标准物质，用磷酸盐缓冲溶液溶解并定容为1 mg/mL的标准溶液，分装后-20℃保存备用，不可反复冻融使用。

脱脂牛奶：称取适量脱脂奶粉，用蒸馏水配制成质量分数为25%的脱脂牛奶。

1%淀粉指示液：取可溶性淀粉1 g，加水5 mL搅匀后，调成糊状，再加蒸馏水80 mL，加热，使其溶解，最后用蒸馏水稀释至100 mL。现用现配。

1.3 方法

1.3.1 杯碟法

按照《关于印发全国打击违法添加非食用物质和滥用食品添加剂专项整治抽检工作指导原则和方案的通知(食品整治办[2009]29号)》附件3中指定检验方法《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法-杯碟法》进行检验。

1.3.2 碘量法

取1 mL脱脂牛奶于试管中，依次加入1 mL100、80、60、50、40、30、20 U/mLβ-内酰胺酶标准溶液，在37℃水浴中恒温振荡40 min，加入1%淀粉溶液50μL，再加入浓度为0.1 mol/L碘标液20μL，不断振荡，于2 min内观察颜色变化情况。

1.3.3 快速检测法

取出一片阳性质控药片到质控物配制管中，再加入1 mL的蒸馏水或阴性牛奶，充分混匀配成阳性质控溶液。调节孵育器温度至56℃。取阳性质控溶液50μL到离心管中，再加入375μL待检测样品充分混匀，静置40 min，配成待检溶液。取出检测条，水平放置在孵育器上，小心揭开黏膜至指示线处。用移液器取300μL已配好的待检溶液，缓慢竖直滴加至检测条的凹槽中。将贴膜重新封好，盖上孵育器塑料盖，自动开始倒计时。孵育8分钟结束后，蜂鸣器响动，取出检测条，3 min内判读结果。

2 结果与分析

2.1 杯碟法

根据《乳及乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检验方法-杯碟法》中结果报告部分进行判定，判定前应首先确定纯水的抑菌系统成立，然后根据系统不同添加物的抑制圈的大小差异进行判定。实验结果如表1所示。

表1 杯碟法灵敏度实验结果

该方法采用的标准菌株藤黄微球菌对青霉素类药物绝对敏感，舒巴坦可特异性抑制β-内酰胺酶的活性，青霉素作为底物，通过比对样品添加与不添加β-内酰胺酶抑制剂（舒巴坦）所产生的抑制圈的大小来间接测定样品中是否含有β-内酰胺酶。根据实验结果，当β-内酰胺酶浓度在4 U/mL时，能够判定检出，故该方法的检出限为4 U/mL，与方法限定相符。

杯碟法的实验操作较为繁琐，包括以下多个步骤，菌悬液制备、样品制备、检验平板制备、放置牛津杯、检样分组处理、加样培养、测量抑菌圈等，要求操作者具有较高的实验技术和丰富的经验。该方法的检出限灵敏，为β-内酰胺酶检验的制定方法，故针对其实验条件进行优化的研究较多，为该方法的实施积累了经验[14-15]

，有研究给出了青霉素G和舒巴坦的最佳使用质量浓度，并指出不同厂家的β-内酰胺酶的检测限不同，以此为基础对杯碟法进行了优化[16]。有研究针对指示菌的浓度和培养时间等对实验结果的影响提出了优化方案[17]。

2.2 碘量法

添加淀粉溶液和碘标液后，在2 min内能进行判定。2 min内使蓝色完全消退的为阳性，不消退者为阴性，即白色表示含有β-内酰胺酶，蓝色为不含β-内酰胺酶。实验结果如表2所示。

表2 碘量法灵敏度实验结果

β-内酰胺酶的亲核基团可将青霉素开环形成青霉酸，随后脱羧重排生成青霉噻唑酸(benzylpenicilloic acid，BPA)，青霉噻唑酸可与淀粉竞争性结合游离碘，从而破坏碘与淀粉生成的蓝色复合物，使蓝色变为无色。根据实验结果，当β-内酰胺酶浓度在25 U/mL时，出现部分褪色的情况，说明此条件下β-内酰胺酶催化青霉素的产物不足以完全结合碘，不能定性；当β-内酰胺酶浓度在30 U/mL时，可在2 min时间内完全褪色，满足定性判断要求，因此，认定该方法的检测限为30 U/mL。

该方法的操作简单但是也存在较多制约因素：（1）实验要求2 min内进行判读，原因分析如下：第一，碘和淀粉形成的碘-淀粉包合物不稳定，容易分解出现褪色；第二、淀粉分子末端的醛基会被碘氧化，也会造成褪色。（2）牛乳中含有的脂肪也会与碘发生反应，可通过离心或者甲醇提取等方法去除牛乳中的脂肪。（3）牛乳本身为乳白色不利于褪色反应的观察，因此除整组实验需设置空白对照、阴性对照、阳性对照外，每组检样可设置阴性对照，以便对比观察反应结果。

2.3 快速检测法

孵育器中取出后3 min内进行判定，如果检测线的颜色和控制线的颜色一致或者比控制线颜色深，则判断样品为阳性。如果检测线的颜色不可见或者比控制线颜色浅时，则判断样品为阴性。也可使用读数仪进行判定，当读数仪读数结果为小于等于+500时可以判定为β-内酰胺酶阳性，当大于+500时判定为β-内酰胺酶阴性。实验结果见表3。

该方法为一种免疫分析方法，基于极低浓度的β-内酰胺酶便可催化水解一定浓度的青霉素G，然后通过配体-受体识别法快速检测与反应后残留的青霉素的含量，间接检测样品中是否含有β-内酰胺酶。根据实验结果，当β-内酰胺酶浓度在4 U/mL时，肉眼无法判读，但读数仪读数结果均高于500，判定检出。因此，认定该方法的检测限为4 U/mL。

表3 快速检测条灵敏度实验结果

该方法检验过程包括以下3个关键点：（1）将质控物和待检测牛奶样品混合；（2）β-内酰胺酶和质控物青霉素G快速反应；（3）在56℃孵育8 min过程中，在测试条的检测线（T线）处可以检测到剩余的青霉素。如牛奶样品中有β-内酰胺酶，测试条的检测线（T线）区会出现红色条带，而控制线（C线）区会出现浅红色的条带。如牛奶样品中没有掺杂β-内酰胺酶，或者β-内酰胺酶的量少于可检测到的范围，在测试条上控制线（C线）区有出现红色条带，检测线（T线）区会出现浅红色的条带。此外，在检验中会出现检样中乳脂或蛋白含量很高，导致检测条的质控线（C线）不现色，可离心后除去脂肪、蛋白层后进行检测。

3 结论

综合3种方法的检验原理、所需设备等方面进行比较，简要的比较情况如表4所示。

表4 3种方法的综合比较

由表4可以看出，杯碟法作为国家推荐方法，在灵敏度上具有很好的优势，但是该方法实际操作中需要大量的准备工作，操作过程繁琐，从准备试验到判定结果，需要2～3 d才能完成，同时对实验操作人员的经验和操作能力有着极强的要求。碘量法相对快速，操作简单，实验成本较低，但是其灵敏度难以达到要求。快速检测法操作简单，速度快，且灵敏度高，但其成本相对较高。因此，在实验条件相对落后的奶站等从业机构进行自检时，建议采用碘量法这种成本较低的检验方法作为初筛方式，对于阳性样品可以直接拒收，对于未出现阳性反应的样品也应送有资质的相关食品检验机构进行检验，确保乳品质量；在相关食品检验机构应按照《乳与乳制品中舒巴坦敏感β-内酰胺酶类药物检测方法—杯碟法》进行检验，且应做好方法确认，在实验中可根据实验室情况进行优化，以保证实验的准确性，如有应急检验可采用杯碟法和快速检测法一同开展检验，快速检测法获得初步结论，杯碟法进行验证；在大型乳品企业可采用快速检测条，在保证检验灵敏度的同时，尽可能缩短检验时间，保证生鲜乳尽快的投入乳品生产，使人们能享受到更新鲜、更安全的乳品。