PCR技术结合试纸条法快速检测乳粉中的克鲁诺杆菌

姜霞，王蕊,潘瑞丽，孙露宏，李明雨，党芳芳，赵玥明，曲艳艳，满朝新，姜毓君b

(东北农业大学a.食品学院,乳品科学教育部重点实验室；b.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150030)

0 引言

婴幼儿配方奶粉为婴幼儿提供了生长发育营养成分的同时，其安全性受到广泛关注[1]。克鲁诺杆菌（原阪崎肠杆菌）[2-3]，能够引起新生儿脑膜炎，脓毒血症等，致死率高达40%～80%[4]。而婴幼儿配方奶粉作为克罗诺杆菌生长的天然培养基，是婴幼儿患病的主要渠道[5-6]，因此快速检测该菌具有重要意义。传统的检测方法耗时长，结果呈现慢[7-8]。而迅速发展的PCR法技术检测时间相对短，灵敏度较高[9-11]。其结果通过电泳进行分析，容易导致机体致癌致突变[12]，因此试纸条方法通过抗体的结合使用，特异性强[13]。目前针对克鲁诺杆菌设计的PCR产物结合试纸条方法并未报道。本研究特异性识别PCR产物的方式来进行克鲁诺杆菌的特异性检测，为食源性致病菌的快速检测提供理论依据。

1 实 验

1.1 材料

培养基及主要试剂：胰蛋白胨大豆琼脂培养基（TSA），琼脂粉，缓冲蛋白胨水(BPW)，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖，细菌全基因组DNA提取试剂盒，婴幼儿配方奶粉，胶体金。

仪器与设备：Bcn1360型生物超净工作台，TGC-16G型离心机，DHP-9272型电热恒温培养箱，电热恒温水浴锅，高压蒸汽灭菌锅，9700 PCR扩增仪，DYY-10C型电泳仪，UVP凝胶成像系统，点膜仪，切割机。

1.2 方法

1.2.1 引物序列

针对ompA基因设计克罗诺杆菌的特异性引物，引物序列如下。

表1 PCR引物序列

1.2.2 菌种的培养和DNA的提取

选取阪崎克鲁诺杆菌ATCC29544作为实验菌株进行相关实验，菌株从保藏在-80℃冰箱中取出，按3%的接种量接种到TSB液体培养基中，活化培养12 h，之后进行TSA固体培养基上进行三区划线，培养16 h,挑取单菌落于TSB液体培养基中，12 h后进行DNA提取。采用水浴法提取培养后的菌液的DNA，10 000 r/min离心3 min后，加入50μL TE缓冲液（20 mmol/L Tris，2 mol/L EDTA，1.2%Triton X-100，pH=8.0），水浴100℃，10 min后进行冰浴5 min，然后离心10 000 r/min，1 min取上清，上清即为DNA模板。

1.2.3 PCR方法的建立

建立PCR反应体系（25μL），其中F3和B3分别标记FITC和生物素，反应体系如下。

表2 PCR反应体系

避光条件下进行PCR反应,反应条件如下：

1.2.4 试纸条方法的建立

将制备好的金标FITC抗体分别喷涂到金标垫上，进行37℃烘干备用。取样品垫，吸水纸，硝酸纤维素膜，烘干的金标垫依次粘贴到底板上，将多克隆抗体羊抗鼠IgG（1 mg/mL）和链霉亲和素（1.5 mg/mL）用喷膜仪进行1μL/cm进行喷涂固定，将所获得的试纸条存放于4℃下干燥备用，其中单独出现C线为阴性结果，C、T线全出为阳性结果，单独出现T线为无效结果。

1.2.5 特异性实验的验证

针对7株克鲁诺杆菌和24株非克鲁诺杆菌进行特异性实验，将24株非克鲁诺杆菌进行活化培养后，提取菌液的DNA然后进行PCR扩增，将获得的目标PCR产物进行特异性的试纸条验证。

1.2.6 纯培养物中的检测

挑取单菌落进行活化培养后，并二次活化培养12 h后的阪崎克鲁诺杆菌菌液ATCC29544进行梯度稀释，将所获得不同浓度的菌液（5.6×108,5.6×107,5.6×106,5.6×105,5.6×104,5.6×103,5.6×102,5.6×101mL-1）以及无克鲁诺杆菌的培养液为阴性对照进行DNA提取和PCR扩增，所获得的PCR扩增产物分别进行电泳法和试纸条检测。

1.2.7 人工污染婴幼儿奶粉中的检测

选取1 g不含克鲁诺杆菌的婴幼儿配方奶粉溶于8 mL 0.85%的生理盐水中，将梯度稀释的克鲁诺杆菌菌液以及无克鲁诺杆菌的培养液为阴性对照进行人工染菌实验，获得不同浓度污染奶粉的克鲁诺杆菌的浓度（5.6×107,5.6×106,5.6×105,5.6×104,5.6×103,5.6×102,5.6×101g-1）以及无阪崎克鲁诺杆菌的奶粉样品为阴性对照，将所获得的人工污染样品，进行DNA提取和PCR扩增，所获得的PCR扩增产物分别进行电泳和试纸条检测。

2 结果与分析

2.1 特异性实验的验证

针对7株克鲁诺杆菌和24株非克鲁诺杆菌进行特异性实验，将31株阪崎克鲁诺杆菌和非克鲁诺杆菌进行活化培养后，提取菌液的DNA然后进行PCR扩增后试纸条检测，得到7株克鲁诺杆菌呈现阳性结果，24株非克鲁诺杆菌呈现阴性结果，说明此方法特异性良好。

2.2 纯培养物中的检测

将所获得不同浓度的菌液（5.6×105,5.6×104,5.6×103,5.6×102,5.6×101，5.6，5.6×10-1mL-1）以及无克鲁诺杆菌的培养液为阴性对照，进行DNA提取和PCR扩增后，所获得的克鲁诺杆菌的PCR扩增产物进行试纸条检测最低检测限为5.6×101mL-1。

图1 纯培养物中克罗诺杆菌的检测结果

2.3 人工污染婴幼儿奶粉中的检测

将所获得不同浓度人工污染奶粉的克鲁诺杆菌的浓度（5.6×104,5.6×103,5.6×102,5.6×101,5.6 g-1）以及无克鲁诺杆菌的奶粉样品，进行DNA提取和PCR扩增，所获得的克鲁诺杆菌的PCR扩增产物进行试纸条检测最低检测限为5.6×102g-1。

图2 人工污染婴幼儿奶粉中克罗诺杆菌的检测结果

3 结论

本研究通过设计无探针标记的方式，并通过煮沸法快速提取菌液和婴幼儿配方奶粉中的克鲁诺杆菌，通过优化PCR技术和试纸条方法快速检测奶粉中的克鲁诺杆菌，通过特异性标记的FITC和生物素来特异性识别试纸条上的抗体，能够高效快速的检测奶粉中的克鲁诺杆菌，研究表明，纯培养物中克鲁诺杆菌的检测限为5.6×10 mL-1，而人工污染奶粉样品中的克鲁诺杆菌的检测线为5.6×102g-1。本研究通过建立的PCR结合试纸条技术快速检测婴儿配方乳粉的克鲁诺杆菌，舍弃了前人研究的设计探针的步骤，操作简单，为食源性致病菌的快速检测的提供一个新的研究方向和研究思路，并为核酸扩增的检测方式提供了新的研究思路，具有重要的研究价值。