东北虎胎盘PLAC-8基因的分离与结构分析

李 倩 元虹懿 杜海荣 张明海

(东北林业大学野生动物资源学院，哈尔滨，150040)

胎盘特异蛋白8(placenta-specific8，PLAC-8)是一种富含半胱氨酸的蛋白。广泛分布于真核生物中。PLAC-8最初是在怀孕8.5～12.5 d的小鼠胎盘中发现的，其在胎盘中的表达是在胎儿中的10倍，主要在胎儿植入子宫之前的滋养外胚层细胞和滋养层巨噬细胞以及随后发育的成胶质层细胞中表达，起到连接胎儿和母体的作用[1-2]。在成年个体中，PLAC-8基因在人的浆细胞样树突状细胞和免疫系统中的淋巴结、脾和骨髓中高度表达，在外周血白细胞、阑尾和胎儿肝脏和胸腺中低表达，在心脏和大脑中不表达[3-4]。其功能也得到越来越广泛的研究。发现其不仅可以调控细胞的分裂、分化和凋亡，还在机体免疫过程中发挥重要作用。国外多项研究结果表明，PLAC-8可能是胚胎着床过程中的关键分子，可作为生物标志分子之一预测动物的妊娠结局。

1 材料与方法

1.1 材料

东北虎(Pantheratigrisaltaica)胎盘cDNA文库为本实验室构建，滴度为2.79×106pfu/mL。

1.2 方法

利用通用引物对胎盘组织原始文库中大量随机挑取单菌落进行双向测序，采用Cross-match软件去除EST中低质量序列、载体序列、重复序列等，利用Seqman软件对高质量的ESTs序列进行聚类和拼接，得到重叠群和单拷贝EST。对拼接后的序列采用BLASTX和BLASTN程序(https：∥blast.ncbi.nlm. nih.gov/Blast.cgi)，在NCBI Genbank核酸库中进行序列同源性比对，利用同源克隆的方法，根据PLAC-8基因的全长设计引物PLAC-8-F(5′-GCCCTTCGGAACTTAGCCTT-3′)和PLAC-8-R(5′-AGCAGGTGCAGTGTGTCATT-3′)进行PCR扩增，反应条件为94℃ 5 min；94℃ 30 s，50℃ 40 s，72℃ 45 s，35个循环；72℃ 5 min。PCR产物经1%的凝胶电泳检测，转化到感受态大肠杆菌DN5a，挑去阳性菌落进行培养，摇菌制备质粒，并对菌落质粒DNA进行双向测序。

1.3 序列分析

采用ORF finder(https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找序列的开放阅读框，使用NCBI的Blastx程序进行氨基酸同源性比较。软件SignalP3.0预测蛋白的信号肽，TMpred软件预测此蛋白的跨膜区。ExPASy ProtParam对氨基酸蛋白质相对分子量、理论等电点以及蛋白质的亲疏水性等性质进行了分析；PSORT II和SOPMA软件进行蛋白的亚细胞定位及二级结构预测；根据SWISS-MODEL软件准确预测蛋白质的三级结构；利用软件MEGA 7.0进化树的绘制，对蛋白的亲缘关系进行分析。

2 结果

2.1 PLAC-8基因全长cDNA的获得

对东北虎胎盘组织cDNA文库中得到的PLAC-8基因的阳性菌落进行PCR鉴定，得到一条长度在300 bp左右的DNA插入片段(图1A)，进一步对该阳性克隆进行质粒提取及双向测序，测序结果为648 bp，与预测片段大小一致(图1B)。其中CDS区域长度为330 bp，共编码了109个氨基酸的蛋白。经GenBank数据库进行Blast比对分析，证实为PLAC-8基因的全长序列(图1C)。

图1 A.东北虎胎盘PLAC-8基因cDNA菌落PCR结果；B.东北虎胎盘PLAC-8基因克隆PCR结果；C.PLAC-8基因的cDNA及推定的氨基酸序列。起始密码子(ATG)，终止密码子(TAA)，终止由星号(*)表示Fig.1 A.The PCR results of PLAC-8 gene in placenta cDNA colony；B.The cloning PCR results of PLAC-8 gene；C.The cDNA sequence and deducedamino acid sequence of the PLAC-8 gene.The initiation codon(ATG)，the termination codon(TAA)，stop code is marked with an asterisk(*)

2.2 PLAC-8基因序列分析

对获得的序列应用NCBI的ORF程序进行开放读码框的查找，结果显示，5′非翻译区为93 bp，3′非翻译区为225 bp，开放读码框为330 bp，编码109个氨基酸；使用ProtParam程序预测该蛋白的相对分子质量为11981.98，理论等电点(Theoretical pI)为6.01，整个氨基酸组成中半胱氨酸(Cys)占最大比例(11.9%)、甘氨酸(Gly)(10.1%)和亮氨酸(Leu)(9.2%)；Expasy Protscale 程序分析PLAC-8蛋白亲水性/疏水性的结果如图2所示，PLAC-8蛋白氨基酸残基中以P507疏水性最强(1.833)，以P134亲水性最强(-0.467)，疏水氨基酸的数量大于亲水氨基酸，故推断PLAC-8为疏水性蛋白。

SignalP 4.1软件预测其一级结构N-端氨基酸不具有信号肽特征；利用在线工具TMHMM 2.0 对PLAC-8氨基酸序列的跨膜结构域进行预测，PLAC-8蛋白N端在细胞膜内的可能性为0.10438，预测PLAC-8蛋白不具有跨膜区。使用PSORTⅡ软件进行亚细胞定位分析表明，该蛋白主要存在于细胞质(39.1%)、细胞核和线粒体(26.1%)；SOPMA 软件预测结果显示，PLAC-8二级结构元件主要以α-螺旋和无规则卷曲为主(分别占41.28%，34.86 %)，其次是延伸结构(13.76%)，最少的为β-转角结构(10.09%)(图3A)。

采用 SWISS-MODE建模方式对PLAC-8蛋白进行三维空间模型(图3B)。推导PLAC-8 蛋白模型分值为 0.38，蛋白序列的相似性为 36.36%。

图2 PLAC-8蛋白的亲水性、疏水性Fig.2 Prediction on hydrophobicity/hydrophilicity of PLAC-8

图3 A.PLAC-8 的二级结构预测；B.PLAC-8 的三维结构预测Fig.3 A.Prediction on secondary structure of PLAC-8；B.Prediction on tertiary structure of PLAC-8

2.3 不同物种间PLAC-8的同源性分析

从GenBank中选取部分动物，将东北虎PLAC-8氨基酸全序列进行BlastX，发现与家猫(Feliscatus)、美洲豹(PantheraPardus)、大熊猫(Ailuropodamelanoleuca)、狼(Canislupus)、白犀(Ceratotheriumsimumsimum)等哺乳动物PLAC-8具有较高同源性(80%～99%)，其中与家猫、美洲豹和猎豹(Acinonyxjubatus)的同源性最高(99%)；而与马来穿山甲(Manisjavanica)、埃及果蝠(Rousettusleschenaultii)和野猪(Susscrofa)的PLAC-8氨基酸序列之间的变异程度较大，同源性较低，分别为80 %。经Mega 7.0 ClustalX聚类分析后，采用Neighbor-Joining法，在进行1000次bootstrap统计学检测的基础上构建进化树(图4)。结构表明，东北虎与家猫和猎豹的PLAC-8蛋白处于同一进化分支，说明在遗传进化中东北虎与家猫和猎豹的亲缘关系较近。由系统发育树图知，PLAC-8基因进化关系复杂多样，不同物种的PLAC-8基因多为不同的类群。

图4 东北虎PLAC-8蛋白系统发育分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of PLAC-8 protein

3 讨论

胎盘特异性抗原8，又称作C15，首次在人(Homosapiens)树突状细胞[5]发现。在小鼠(Musmuscalus)中PLAC-8蛋白由112个氨基酸(amino acid，aa)组成，人和黑猩猩(Pantroglodytes)的PLAC-8蛋白都是由115个氨基酸(aa)组成，并且序列完全一致，东北虎的PLAC-8蛋白编码109个氨基酸，可见哺乳类的PLAC-8具有相似的特性。PLAC-8蛋白的分子结构目前并不清楚，就该分子的一级结构而言，第30～110个氨基酸之间有很保守的半胱氨酸(Cys)富集区，并且此半胱氨酸富集区在脊椎动物中很保守[6]。多数半胱氨酸形成一个CXXC结构，该结构包含3～4个分子内二硫键，是该分子底物的特异性结合位点。PLAC-8分子的N端没有明显的信号肽结构，所以该分子是否可以分泌到细胞外，目前尚无一致报道。高等动物的PLAC-8基因有很高的同源性，但在两栖和低等动物的相似性很低。这表明，PLAC-8在进化早期阶段是不稳定的，到爬行动物的结构开始稳定并不再改变时表明PLAC-8的功能比之前更加稳定和重要[7]。

PLAC-8广泛分布于真核生物中[8-9]进化上相对保守。PLAC-8蛋白在卵母细胞和不同发育阶段的早期植入前胚胎均有表达，主要分布在细胞质。近期在人的胎盘研究中发现PLAC-8定位于绒毛外滋养层细胞(extravillous trophoblast，EVT)，可促进滋养层细胞的浸润迁移。最近我国科学家进行了一项人类围种植期胚胎单细胞核糖核酸(ribose nucleic acid，RNA)测序的研究[10]，从中数据挖掘显示PLAC-8从卵母细胞到桑椹胚期表达都很低，在囊胚期表达开始升高，同时滋养外胚层与内胚层、外胚层之间表达有显著差异，壁层滋养外胚层与极滋养外胚层表达也有一定差异，但单细胞之间表达差别较大。有关PLAC-8的生殖生物学功能研究尚处于起步阶段，PLAC-8在早期胚胎的表达、定位及胚胎早期植入过程中是否表达目前尚无人报道。