序批式秸秆牛粪混合厌氧干发酵影响因素研究

于佳动，赵立欣，冯 晶，姚宗路，黄开明，罗 娟

（农业农村部规划设计研究院农村能源与环保研究所，农业农村部农业废弃物能源化利用重点试验室，北京 100125）

0 引 言

厌氧发酵生产沼气是中国绿色农业发展过程处理农业废弃物的重要手段。随着中国沼气工程转型升级工作的深入推进，规模化大型沼气工程和规模化生物天然气工程成为沼气工程建设的主流[1]。目前，中国农业废弃物沼气工程普遍采用湿法厌氧发酵技术，工艺较为成熟，运行过程容积产气率保持在0.8～1.0 m3/(m3·d)[2]。随着原料收集方式的改变，特别是养殖场干清粪收集方式的普遍应用，提高了原料的含固率，为干法厌氧发酵技术的推广创造了条件，高效、稳定的产气工艺是干法厌氧发酵推向规模化应用的关键。

干法厌氧发酵具有提高废弃物处理量、降低能耗、提高容积产气率等优点。而且，发酵过程沼液产量少，沼渣可直接用于有机肥的生产，大大提升了农业种养结合的良性循环能力[3]。国外发展干法厌氧发酵技术起步较早，20世纪90年代，欧洲干法厌氧发酵沼气工程占有率近50%，法国Valorga、比利时Dranco、瑞典Kompogas等公司的连续干发酵工艺，以及德国BEKON、Bioferm、GICON公司的序批式厌氧干发酵工艺已产业化[4-5]。随着工程建设技术的不断完善，序批式厌氧干发酵技术在处理富含纤维的农业废弃物方面具有独特的优越性，通过铲车等机械设备一次性进出料，在密封空间内实现高效产气，操作简单、自动化程度高，运行成本低[5]。然而，中国对序批式干法厌氧发酵技术研究虽然起步较早，但发展缓慢，特别是利用序批式厌氧发酵处理农业废弃物方面，还未见有落地工程报道，其中最主要的原因是对影响序批式厌氧干发酵产气特性的关键因素尚不明确，影响了工艺优化效率。

含固率、物料配比、接种物浓度等是影响序批式厌氧干发酵产气效率的重要因素[6]，已有研究对影响序批式厌氧干发酵产气效率的研究仅集中在 1～2个因素，并缺乏有效关联[7-8]。而且，喷淋是序批式厌氧发酵增加传质的主要方式，对喷淋频率、喷淋量的研究却很少考虑其他因素的影响[9]。因此，本研究提出将影响序批式厌氧干发酵效率的因素相结合，整体探究影响序批式厌氧干发酵性质的关键因素，并对微生物群落进行分析，揭示其与各因素间的相互作用关系，为下一步准确研究序批式厌氧干发酵沼气生产工艺提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用农业废弃物为玉米秸秆和牛粪。玉米秸秆来自河北省张家口市崇礼县农田，放置室温（25 ℃）通风处保存，混料前测得TS、VS分别为90.71% ± 0.06%、76.28% ± 0.09%；牛粪取自河北省廊坊市三河市内牛场，取回后进行风干处理，以调节试验设定的含固率。并且，前期通过预试验证明，风干后的牛粪不会对物质组分造成显著性影响。牛粪TS为56.78% ± 0.25%，VS为46.32%±0.13%；接种污泥取自北京市顺义区赵全营镇北郎中村沼气厂，混料前，取适量污泥在（38 ± 0.5）℃的厌氧条件下培养至不产气，测得TS为31.15% ± 0.15%，VS为17.46% ± 0.18%。

1.2 反应装置

序批式厌氧干发酵反应器为有机玻璃材质，有效体积10 L，物料填装在孔径5 mm的筛网盘上，垂直物料上方中心处设有喷淋头，喷孔孔径为0.3 mm，向物料表面喷洒渗滤液，渗滤液延渗滤管流入5 L的渗滤液收集罐；反应器有循环水夹层，通过热水浴循环维持反应器发酵温度；收集的渗滤液经回流管道由蠕动泵控制回流喷淋；产生的沼气流经湿式气体流量计计数，并用集气袋进行收集。

1.3 试验设计

以秸秆和牛粪为混合原料，含固率、物料配比、接种物浓度、秸秆粒径，以及喷淋频率、喷淋量为因素，采用Plackett-Burman设计法[10]，共设计12组试验，因素内的最低值和最高值是根据国内外报道的序批式厌氧干发酵各因素试验参数范围设定的[6,8-9]，如表1所示。玉米秸秆粉碎至1、5 cm两种粒径，进料后，密封反应器，发酵温度为（38 ± 0.5）℃，渗滤液回流喷淋频率和喷淋量由时间继电器自动控制，12组序批式厌氧干发酵反应装置同时运行，试验周期为40 d。

表1 12组序批式厌氧干发酵试验设计表Table 1 Experimental design for 12 groups of batch dry anaerobic digestion

1.4 分析方法

TS、VS测定参照美国 APHA方法[11]。试验运行过程中，每天记录气体流量计读数，即沼气产量（L）。使用便携式沼气成分分析仪（Biogas check，Geotech，英国）测定沼气中的甲烷含量（CH4%）。使用便携式 pH计（SX-610，上海三信，中国）和ORP计（SX-630，上海三信，中国）监测发酵过程的pH值和ORP（氧化还原电位）。采用气相色谱法分析发酵周期结束时反应器内物料乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸共 6种有机酸组分，测试前样品需12 000 r/min离心30 min，取上清过0.22 μm滤膜，过滤后的液体与甲酸1:1混合后上机测试，测定程序及方法参照文献[12]。采用Miseq高通量测序技术，对发酵周期内物料细菌、古菌特征进行测序评价，在Majorbio有限公司（中国上海）对抽平后的测序结果进行微生物属水平进行群落结构分析[13]。

基础数据处理、显著性差异分析基于Microsoft Office 2016软件平台，对不同因素贡献度的计算分析使用Design-Expert v8.0软件[10]，使用Canoco v4.5对不同因素作用下测定的发酵指标进行典型相关性分析。

2 结果与分析

2.1 序批式厌氧干发酵产气特性

不同因素组合条件下的12组序批式厌氧干发酵日产沼气性质如图1a、b所示，发酵第1天，产气出现高峰，第5天时，反应器A、C、D、E的容积产气率开始不同程度回升，平均容积产气率（L/(L·d)）排序为E（1.52）＞D（1.02）＞C（0.88）＞A（0.80），反应器L在发酵第7天后容积产气率不再下降，维持在(0.70 ± 0.20) L/(L·d)，而其他反应器均无明显的产气现象。从多因素组合中可以看出，除反应器L外，反应器A、C、D、E、L反应器产气明显，喷淋频率均为间隔2 h喷淋，反应器A、E在发酵6～13 d产气呈升高趋势，随后A开始逐渐下降，而E在前27天均可维持较高的产气水平，与反应器A相比，反应器E原料中牛粪含量高，间接增加了接种物数量[14]，秸秆粒径增大，降低了秸秆快速水解产酸对反应体系的冲击[15]。反应器C和D在经历5～15 d的延滞期后容积产气率上升，随后反应器C容积产气率逐渐平稳，而反应器D持续上升，在发酵30 d后出现第2次产气高峰，与反应器C相比，反应器D含固率、牛粪比例高，秸秆粒径小，且接种物浓度为反应器C的5倍，虽然干发酵过程中含固率过高易引起沼气产量的下降，但若保证充足的接种物数量有助于反应体系恢复产气[16]。喷淋频率高可显著促进序批式厌氧干发酵容积产气效率的提升（P＜0.01），增加喷淋频率可提高序批式干发酵体系接种物的流动性，通过润湿物料，促进微生物的传质效率，有利于沼气生产[9]。

甲烷含量如图1c、d所示，发酵前10天，不同反应器的甲烷体积分数均在50%以下，反应器A、E的甲烷体积分数升高明显，10 d后保持在50%以上，稳定在54.17%± 2.50%和57.50% ± 3.24%，反应器C、D甲烷含量升高缓慢，到发酵第15和18天甲烷体积分数上升到50%以上，反应器 L虽然也有甲烷生成，但整个发酵过程甲烷体积分数不超过42.40%，其他反应器在前5天可检测到少量甲烷，但由于干发酵初期甲烷菌活性低、生长速率慢[14]，伴随着体系不产气，甲烷含量为0。

图1e、f显示了多因素组合下序批式厌氧干发酵反应器日产甲烷特性，反应器A、C、D、E和L甲烷生成明显，与日产沼气变化规律相比，发酵初期由于甲烷体积分数低，并不存在产甲烷高峰，发酵5 d后，甲烷产量上升明显，其中反应器E高效产甲烷一直维持到第27天，其他反应器甲烷产量变化趋势与日产沼气规律相同，容积产甲烷率（L/(L·d)）为 E（0.70）＞D（0.36）＞C（0.33）＞A（0.30）＞L（0.26）。喷淋频率高、接种物浓度高、原料中牛粪比例增加均促进甲烷产量的提升。

图1 序批式厌氧干发酵容积产气率和甲烷含量Fig. 1 Volumetric biogas and methane production rate and methane content of batch dry anaerobic digestion

2.2 不同因素对序批式厌氧干发酵产甲烷特性的贡献度分析

多因素影响序批式厌氧干发酵容积产气率的贡献度如图 2所示，喷淋频率对甲烷生产的贡献度最大，为30.84% ± 1.89%，是序批式厌氧干发酵工艺优化的重要环节。渗滤液的循环喷淋可带回大量微生物，通过喷淋可减少接种物的用量，并且为微生物提供主动的转移机制，有助于干发酵体系微生物快速生长及群落结构稳定，提高微生物的活性，进而增加有机物降解效率，促进甲烷生产[17]。由于干发酵反应器不适合安装搅拌装置，所以，欧洲目前运行的大型序批式厌氧干发酵沼气工程普遍装有喷淋设施提升传质能力，促进沼气的高效稳定生产[4]。另外，其他因素对序批式厌氧干发酵甲烷生产贡献度的排序依次为接种物质量分数（24.96% ± 1.16%）＞含固率（9.95% ± 0.89%）＞物料配比（7.00% ±2.34%）＞秸秆粒径（5.16% ± 0.89%）＞喷淋量（0.1% ± 0.03%），可见，围绕序批式厌氧干发酵高效产甲烷工艺的研究，应首先设法通过直接增加接种量或间接调节喷淋频率以促进接种物与底物间的接触，提高接种效率和甲烷产量[7,9]。从本研究可以看出，提升接种效率并促进甲烷生产最有效的方法是直接添加接种物和调节喷淋频率。而且，各因素间存在一定的交互作用关系，含固率和物料配比以及含固率和接种物浓度的共同作用对甲烷产量的提高也具有明显的贡献。所以，在对以农作物秸秆和畜禽粪便混合原料进行序批式厌氧干发酵产甲烷工艺优化时，喷淋频率和接种物浓度应是首先被考虑的优化因素。当干发酵体系含固率为25%、秸秆-牛粪TS配比为3:7、接种物质量分数（TS质量分数）为50%、秸秆粒径为1 cm、喷淋频率为间隔2 h，喷淋量为4 L时，可显著提高容积产气效率（P＜0.05）

图2 不同因素对序批式厌氧干发酵甲烷生产的贡献度Fig. 2 Contribution rate of different factors to methane production in batch dry anaerobic digestion

2.3 不同因素作用下序批式厌氧干发酵有机酸分布特性

序批式厌氧干发酵运行周期结束时，有机酸浓度及组成如表2所示，除了反应器B、F，在其他喷淋频率高的反应器中有机酸质量浓度均不超过 1.84 g/L，Siegert等研究了有机酸累积对厌氧发酵体系甲烷生产的影响指出，当体系有机酸累积超过2.0 g/L，开始抑制产甲烷菌的生长，有发生酸败的风险[18]。本研究中，高喷淋频率反应器（A～F），高接种物浓度及牛粪比例的反应器可及时将体系的有机酸转化为沼气（甲烷）。从有机酸组分浓度上看，发酵过程发生酸败的反应器B、F、G、H、I、J、K，丙酸浓度显著高于其他有机酸组分（P＜0.05），并且丁酸浓度也发生一定的积累。研究表明，丙酸积累引起厌氧发酵体系pH值降低，影响产甲烷活性，在冲击负荷或超负荷情况下会使发酵由丁酸型向丙酸型转化，从生物学角度分析，较高的有机负荷条件下丁酸型发酵的代谢加快，这伴随着较高的NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态)产量，如果这些NADH不能及时的被细胞合成所利用，则导致NADH的积累，必须通过产丙酸途径加以缓解。在本研究中，发生酸败的反应器总酸产量高使体系pH值降低，导致乙酸代谢受到抑制，丙酸和丁酸发生积累[19]。另外，邓玉营等[20]在研究秸秆干发酵过程沼液回流比和有机负荷对厌氧发酵特性的影响中发现，严重酸败的干发酵反应器中，丙酸、丁酸发生明显的积累，其中丙酸累积质量浓度高达6.54 g/L。

表2 序批式厌氧干发酵有机酸及其组分质量浓度Table 2 Organic acid and their component concentration in batch dry anaerobic digestion mg·L-1

2.4 不同因素作用下序批式厌氧干发酵细菌、古菌组成特性

为了更加深入的揭示序批式厌氧干发酵关键因素对甲烷生产的影响，依托高通量测序技术对各反应器中的关键细菌、古菌群落进行分析，如图3a所示（细菌），属水平 Ruminofilibacter、Hydrogenispora、Ruminiclostridium丰度随着反应器甲烷产量的提高而显著增加，在反应器A、C、D、E、L中的丰度分别为 9.30%～33.70%、6.30%～11.00%、8.50～14.90%。3种细菌均为木质纤维素分解菌，经常出现在以秸秆为原料的厌氧发酵体系中，特别是Ruminofilibacter、Ruminiclostridium，通过分泌大量纤维素、半纤维素酶水解木质纤维素，生成以乙酸、丁酸为主的适合产甲烷菌利用的酸化产物，促进产甲烷效率[13,21]。另外，在本研究中，Clostridium丰度升高不利于甲烷生产，Clostridium在低pH值环境依然有较强的水解产酸能力，在中温环境中，Clostridium的过多出现预示着反应体系的酸败[21-22]。在2.2节中，揭示了增加喷淋、提高接种物浓度是序批式厌氧干发酵产甲烷的关键因素，含固率、物料配比（牛粪多）、接种物浓度间也具有一定的协同作用关系，导致了序批式厌氧干发酵体系细菌群落的变化，表现为Clostridium的生长受到抑制，提 高 了 Ruminofilibacter、 Hydrogenispora、Ruminiclostridium丰度水平。另外，一种具有高效分解木质纤维素能力的 Paeniclostridium[21]，在喷淋频率低的反应器中略有升高。在图3b显示的不同反应器的产甲烷菌丰度中，Methanosarcina为优势古菌，丰度为 62.4% ±12.8%，几乎不受各因素的影响。Methanosarcina为嗜乙酸型产甲烷菌，抗逆性较强，是干发酵体系的优势古菌，可高效利用有机酸转化为甲烷[23]。此外，另一种嗜乙酸型产甲烷菌Methanoculleus的平均丰度为9.6% ± 5.1%，体系内嗜乙酸产甲烷菌的平均丰度达到72.0% ± 17.9%。可见，各因素作用于序批式厌氧干发酵体系主要通过改变细菌群落影响产甲烷潜力，对古菌的影响较弱。

图3 序批式厌氧干发酵细菌、古菌群落特征Fig. 3 Characteristics of bacteria and archaea community in batch dry anaerobic digestion

2.5 序批式厌氧干发酵影响因素与发酵性质及微生物群落间的相互作用关系

如图 4所示，各反应器在不同因素作用下，喷淋频率和接种物浓度与沼气产量、甲烷产量存在显著的正相关协同作用关系（P＜0.01），秸秆粒径也与产气呈正相关性，但影响较小，反应器A、C、D、E随着喷淋频率、接种物浓度的提高容积产气率明显提升（2.1节），pH值为7.0 ± 0.1，受到喷淋频率低的影响，反应器L的pH值仅为 6.7，产气效率下降（2.1节）。Ruminofilibacter、Hydrogenispora、Ruminiclostridium丰度的提高，有利于序批式厌氧干发酵体系的甲烷生产，并与喷淋频率和接种物浓度呈正相关性。当体系含固率增加，物料配比中秸秆比例高、提高喷淋量将不利于甲烷生产，易引起反应体系的酸败，与有机酸产量保持正相关性，但三者与喷淋频率间存在正相关协同作用关系，特别是物料配比与喷淋量，提高物料配比中牛粪的比例和喷淋量有利于甲烷产量的提升。Degueurce 等研究牛粪序批式厌氧干发酵产气特性中证实，提高体系的含固率需缩短喷淋间隔、提高喷淋量，以便及时去除体系中积累的有机酸，防止产气抑制的发生[24]。另外，pH值和氧化还原电位（ORP）呈负相关性，当体系有机酸发生积累，ORP增加，预示着体系传质能力受到了抑制[21]，在本研究中，喷淋频率低的反应器中ORP值普遍较高，也反映出喷淋对提高序批式厌氧干发酵产气能力的重要性。Methanosarcina对提高产气效率具有正相关性，提高含固率和物料中秸秆的比例可促进Methanoculleus生长，但2.4节中研究表明，古菌在序批式厌氧干发酵过程对发酵性质的影响较小，维持甲烷的高效生产，细菌群落起关键作用。通过RDA分析，进一步明确了各因素间的相互作用关系以及给发酵体系带来的影响，可为今后序批式厌氧干发酵工艺优化提供参考。

图4 微生物与环境因子间的RDA分析Fig.4 RDA analysis between microorganism and environment

3 结 论

1）喷淋频率、接种物浓度对促进序批式厌氧干发酵容积产甲烷率的贡献度最大，分别为30.84%和24.96%，适当的提高喷淋频率、接种物浓度和原料配比中牛粪的比例都有利于促进序批式厌氧干发酵体系产甲烷效率，高效产气可持续27 d，容积产甲烷率达0.70 L/（L·d）。

2）细菌群落对序批式厌氧干发酵产气特性影响显著（P＜0.05），在产气效果良好的反应器中Ruminofilibacter，Hydrogenispora，Ruminiclostridium 丰度明显提高，而古菌不受喷淋频率、接种物浓度和秸秆牛粪配比的影响，Methanosarcina为优势古菌。

3）适当提高喷淋频率、接种物浓度均可提高Ruminofilibacter，Hydrogenispora，Ruminiclostridium 丰度和体系容积产甲烷率，三者具有协同作用关系，对改善序批式厌氧干发酵条件具有重要的调节作用。