注射用盐酸青藤碱透明质酸复合凝胶的稳定性研究

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(1临沂市中医医院，山东 临沂 276000；2山东省药学科学院，山东 济南 250033；3山东大学第二医院关节外科)

关节腔内注射药物是治疗骨性关节炎(Osteoarthritis，OA)的重要方法，透明质酸已成为该法经典的药物选择。研究表明，透明质酸凝胶治疗OA的总有效率为80%以上，是治疗OA的一种安全、理想的有效药物。近30多年来，大量的临床资料证明关节腔透明质酸注射不仅仅能缓解OA症状，而且能显著降低关节的退化抑制免疫损害进程。透明质酸为高分子多糖，是直链的大分子，其分子中每一双糖单位含有一个羧基，可解离成负离子，等空间距离的负离子相互排斥，使分子在溶液中呈一定刚性的线团状。当达到一定浓度后，透明质酸分子可相互交错缠绕构成网状结构，使药物分子进入网格中，具有控制药物释放速度的作用。透明质酸作为药物缓释载体具有诸多优点，如优良的生物相容性和可降解性，通过酯化、交联的透明质酸衍生物由于改善了对强酸、强碱、热、自由基的不稳定性及对透明质酸酶的敏感性，使其降解时间延长，更适宜作为药物缓释载体的应用[1]。

青藤碱是从中药青风藤中提取的单体生物碱，临床多用其盐酸盐，具有显著的抗炎、镇痛和免疫抑制作用且本身无成瘾性。对白介素(IL-1β、IL-6)有明显的抑制作用。有研究表明，OA患者血清及关节液中软骨寡聚基质蛋白(Cartilage oligomeric matrix protein，COMP)水平显著升高[2-3]，而青藤碱膝关节腔注射可降低关节液中炎性因子含量，延缓软骨退变进程[4]，其通过对各种炎症因子的抑制作用而发挥对关节软骨的保护作用[5]，这可能与抑制滑膜炎性反应、降低MM-13表达有关[6]。但是，青藤碱生物半衰期较短，对光、热不稳定，易分解。为了克服以上缺点并且观察其与透明质酸联合关节腔注射是否对OA患者能取得更好的疗效，笔者制备了注射用盐酸青藤碱透明质酸复合凝胶，在不同pH值、不同缓冲系和不同辅料条件下对其稳定性进行了研究。现报告如下。

1 资料与方法

1.1药品与仪器 盐酸青藤碱(陕西天成植物工程有限公司)、透明质酸钠(山东福瑞达生物医药有限公司)、半透膜(截留分子量2000)；所有试剂为分析纯。ZRS-4智能溶出试验仪(天津大学无线电厂)，紫外可见分光光度计(Agilent 8453)。

1.2方法

1.2.1不同pH值复合凝胶测定液的制备 在2 mM的磷酸盐缓冲体系中加入2.5%盐酸青藤碱，用盐酸或氢氧化钠调节溶液的pH分别为3～7，0.22 μm滤膜除菌，按1%投入无菌透明质酸钠，加热助溶30 min后过夜，完全溶解后，密封，置40 ℃恒温箱，5 d取样用蒸馏水作10倍稀释，测定其运动黏度(ν)和420 nm波长处的吸光度(A420nm)。

1.2.2不同缓冲系复合凝胶测定液的制备 在2 mM磷酸盐、3 mM醋酸盐、3 mM酒石酸盐、2 mM枸橼酸盐、3 mM硼酸盐5种缓冲体系中各加入2.5%盐酸青藤碱和0.5%氯化钠，用盐酸或氢氧化钠调节pH为6，其它同上。

1.2.3不同辅料复合凝胶测定液的制备 在2 mM磷酸盐缓冲体系中加入2.5%盐酸青藤碱和0.5%氯化钠和其它辅料，辅料的不同组合及比例见表3，其中0、5号管为未添加辅料的青藤碱与不同比例透明质酸钠的复合凝胶测定液，然后用盐酸或氢氧化钠调节pH为6，其它同上。

1.3复合凝胶稳定性的判定 运动粘度表示透明质酸的稳定性，运动黏度值越大透明质酸越稳定。A420nm吸光度表示青藤碱的稳定性，吸光度越小表明对青藤碱影响越小，稳定性越好。

2 结果

2.1不同pH值对复合凝胶稳定性的影响 随着pH值的降低，透明质酸钠的分解加速；而随着pH值的升高，盐酸青藤碱的分解加速。在pH值为6时两种成分相对稳定。见表1。

表1 不同pH值对复合凝胶稳定性的影响

2.2不同缓冲系对复合凝胶稳定性的影响 不同缓冲体系对透明质酸钠稳定性的影响无明显差异，磷酸盐和酒石酸盐缓冲体系中盐酸青藤碱稳定性的影响相对较小。见表2。

表2 不同缓冲系对复合凝胶稳定性的影响

2.3不同辅料对复合凝胶稳定性的影响 络合剂乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、NaHSO3、Na2S2O4、L-半胱氨酸(L-cys)、增溶剂吐温80、环状糊精(β-cyclodextrin，β-CD)、聚乙二醇400(PEG400)、防腐剂山梨酸的加入，对透明质酸钠的稳定性影响不大，但可降低盐酸青藤碱的分解，提高盐酸青藤碱在溶液中的稳定性。见表3。

表3 不同辅料对复合凝胶稳定性影响

3 讨论

3.1复合凝胶的稳定性 关节软骨内透明质酸分子量(Mr)随年龄增加而呈下降趋势，进而软骨基质的构成单位聚乙醇酸(Polyglycolic acido，PGA)的体积明显减小，加上蛋白聚糖和连接蛋白等发生的变化可能是老年人易患OA的主要原因。当患OA时，由于自由基和关节积液等原因，关节内透明质酸(Haluronic acid，HA)浓度和Mr明显降低，使其生理功能发生明显障碍。外源性透明质酸必须具有一定的Mr和浓度并相对稳定才能发挥其治疗作用。所以制备复合凝胶时透明质酸须具有一定稳定性，保持一定的浓度和Mr。本实验表明，各种缓冲对和辅料对透明质酸的稳定性影响较小，但随着pH值的降低其分解加速。而盐酸青藤碱在偏酸的环境中稳定，随着pH值的升高其分解加速。本研究发现在pH值为6时，复合凝胶中的这两种主要成分都相对稳定，所以制备不同的缓冲液和各种辅料对复合凝胶稳定性研究时取pH值为6。

3.2复合凝胶应用的优势 两种药物单独制剂先后注入关节腔，由于透明质酸黏度大，青藤碱注射液不易均匀分散到透明质酸网状凝胶中，难以发挥透明质酸的缓释作用，药物很快分散流失。另外，两者单独制剂联合应用时注射过程中间需更换注射器，这样增加了器械的污染机会，增加膝关节感染的概率，若膝关节内感染将引起灾难性的后果。注射用盐酸青藤碱透明质酸复合凝胶体外制备后可一次将两种药物注射入关节腔，避免了以上风险。