牛乳中酪蛋白的提取以及鉴定

（扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127）

牛奶是最古老的天然饮料之一，被誉为“白色血液”[1]。酪蛋白是牛奶中的主要蛋白，占牛奶中蛋白质总量的80%[2-3]，且是牛奶中主要的过敏原。本实验以牛奶中的酪蛋白为研究对象，通过对目标蛋白的分离纯化，进行电泳分析鉴定[4-5]。为牛奶过敏蛋白的检测以及标准品的制备，提供一定的基础性研究。

1 实验方法

1.1 实验原料与试剂

原料：科迪纯牛奶，伊利纯牛奶，扬大巴氏鲜牛奶。

试剂：丙酮、酪蛋白标准品等均为国产分析纯试剂；十二烷基硫酸钠（SDS）、溴酚蓝、考马斯亮蓝R250、蛋白Marker等，购自上海生物工程股份有限公司。

1.2 实验仪器

台式高速冷冻离心机、H5-6多头磁力加热搅拌器、微型垂直电泳系统、凝胶电泳成像仪、台式pH计、电子天平、恒温水浴锅、脱色摇床。

1.3 酪蛋白粗提和纯化

将3种牛奶倒入离心瓶中低温离心去脂肪，过滤得脱脂奶，调节pH至4.6；后在4 ℃条件下离心获沉淀为酪蛋白；加入等量的丙酮进一步脱脂，抽滤清洗，留样电泳分析。将样品置于透析袋透析36 h后，取出进行冷冻干燥。

1.4 蛋白含量测定以及电泳分析

以蛋白质的含量为横坐标，光吸收值为纵坐标绘制标准曲线。称取3种牛奶样品中粗提的和纯化的蛋白测量吸光度值，计算样品中蛋白质浓度，并采用SDS-PAGE进行鉴定分析。

2 结果与分析

2.1 样品蛋白含量测定

通过检测标品吸光度，可建立一条标准曲线，即y=0.027 9x+0.071 8（R²=0.999 3），带入样品蛋白的吸光度值测出各样品蛋白浓度，见表1。

表1 样品蛋白浓度表

由标准曲线方程以及样品蛋白的吸光度值测得样品中的蛋白浓度，可以得出3种样品的粗提蛋白浓度均小于纯化后的蛋白浓度，而在纯化蛋白中科迪鲜奶的蛋白浓度最高，粗蛋白中伊利鲜奶的蛋白浓度最高。

2.2 SDS-PAGE分析

将纯化后的酪蛋白组分进行SDS-PAGE分析，用凝胶成像与分析系统对电泳图进行光密度扫描，结果以28 kD区带处蛋白条带含量最为明显。查阅相关文献[1]并结合图1可知，酪蛋白为牛奶中主要的过敏原蛋白组分。

图1 样品的SDS-PAGE分析图

3 结论

通过提取纯化酪蛋白，以及SDS-PAGE电泳分析的结果，验证了酪蛋白是牛奶中的主要过敏原蛋白，与其他文献[6]报道相符。酪蛋白的提取条件为4 ℃离心，pH 4.6，此条件下可得的酪蛋白浓度为2.02 mg/mL。