蛇床子素对大鼠颈动脉内膜增生的影响

张宇，孙淑娴，马威，李昌义，王斌，王兆祥，亢小丽，纪征

（河北省唐山工人医院 心内一科，河北 唐山 063000）

冠状动脉疾病通过经皮冠状动脉介入治疗，虽然可以改善患者的心肌血流灌注，但是术后再狭窄成为主要临床问题。由于术后受损血管的自我修复，导致炎症的发生、血管平滑肌细胞增殖并向内膜迁移，从而使血管内膜增厚及再狭窄发生[1]。有研究表明，Toll样受体TLR4（toll-like receptor, TLR4）与核转录因子κB（nuclear transcription factor kappa B, NF-κB）信号通路参与受损血管内膜增生[2-4]。因此阻断TLR4/NF-κB表达，可有效抑制炎症反应、减轻细胞增殖、防止术后再狭窄。蛇床子素为香豆素化合物，常见于蛇床、当归等伞形科中药材，具有抗炎、抗氧化、调节血脂、改善记忆等药理作用[5-6]。本研究采用大鼠颈动脉内皮损伤的模型，予以蛇床子素后，观察其对血管内膜和平滑肌细胞增殖的影响，并对其机制进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

蛇床子素（中国药品检验所，纯度＞98%），小鼠增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）单克隆抗体、DyLight 594红色荧光二抗购自美国Santa Cruz公司，BSA封闭液、DAB显色试剂盒、TBST缓冲液、枸橼酸盐缓冲液购自北京索莱宝生物技术有限公司，TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 试剂盒购自大连凡邦生物科技有限公司，切片机（德国Leica公司CM1900），自动染色机（德国Leica公司AUTOSTAINERXL），自动封片机（德国Leica公司CV5030），光学显微镜（日本Olympus公司BX51），病理图像分析软件Image-Pro Plus 6.0（美国Media Cybernetics公司）。

1.2 动物模型的复制与分组

1.2.1 大鼠颈动脉球囊损伤模型的复制 SD大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠（30 mg/kg）麻醉，颈正中线切口，通过颈外静脉注射肝素钠（100 u/kg），夹闭颈总动脉近心端和颈内动脉远心端，进而阻断血流。于颈外动脉远心端处，剪出斜形切口，在颈外动脉切口处将导引钢丝和PTCA球囊导管（l.5 mm×20.0 mm）逆行插入颈总动脉，距颈外动脉分叉处2.5 cm，向球囊内注入生理盐水直至球囊充盈，抽动并旋转球囊，从而剥脱内膜。假手术组不插入球囊导管，其余各组平行操作。给药干预16 d后处死所有动物，分离左颈总动脉进行实验[7]。

1.2.2 实验动物分组 健康雄性SD大鼠，体重250～300 g，由北京大学实验动物学部提供。实验动物随机分为4组：①假手术组；②模型组：颈动脉球囊损伤组+0.9% NaCl；③低剂量蛇床子素组：颈动脉球囊损伤+10 mg/（kg·d）蛇床子素，1次/d；④高剂量蛇床子素组：颈动脉球囊损伤+30 mg/（kg·d）蛇床子素，1次/d。

1.3 苏木精-伊红染色法

采用苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE）染色，显微镜下观察血管内膜的病理变化，通过Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，测量各组血管内膜和中膜面积比（intima/media，I/M）[8]。

1.4 免疫组织化学法荧光染色

采用免疫组织化学法检测斑块内PCNA[9-10]，组织切片脱蜡后，抗原修复15 min，一抗4℃孵育过夜，荧光二抗37℃避光孵育40 min，PBS漂洗，中性树胶封片。每张切片随机观察3个不同视野，计算PCNA阳性表达指数，PCNA阳性表达指数=PCNA阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.5 ELISA

采用ELISA检测损伤血管TNF-α和IL-1β水平。受损血管预冷PBS洗涤，滤纸吸干水分，加入RIPA裂解液后，在冰水中充分研磨5 min，低温高速离心机4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清，按照试剂盒说明书检测TNF-α和IL-1β水平。

1.6 Western blot检测

收集各组血管，PBS洗2次，用蛋白裂解液在冰上研磨血管3 min，提取蛋白，4℃、12 000 r/min离心10 min，取上清液测定蛋白浓度，配平各组蛋白浓度，蛋白变性，SDS-PAGE电泳后转膜至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭2 h，NF-κB p65（1∶500）或TLR4（1∶200）4℃冰箱过夜，弃一抗，TBST洗膜3次，5 min/次；将膜转入杂交袋，室温孵育二抗（1∶5 000）2 h，弃二抗，TBST洗膜3次，5 min/次；ECL系统显影，采用β-actin作为内参，计算相对灰度值，实验重复3次。

1.7 统计学方法

数据处理采用SPSS 17.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组比较用单因素方差分析（One-way ANOVA），组间两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠血管结构的改变

大鼠球囊损伤后可见动脉内皮剥脱，部分内弹力板由正常的波浪状变平坦，失去弹性；并且新生内膜形成并增厚，新生内膜中可见大量血管平滑肌细胞，纤维成分增多，管腔呈向心或偏心性狭窄，中膜可见血管平滑肌细胞排列紊乱。假手术组、模型组和高、低剂量蛇床子素组的I/M比值分别为（0.14±0.03）、（0.87±0.13）、（0.45±0.14）和（0.56±0.16），经方差分析，差异有统计学意义（F=25.768，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，与假手术组比较，模型组I/M比值升高（t=5.864，P=0.000）；低剂量和高剂量蛇床子素组的I/M比值与模型组比较，差异有统计学意义（t=3.004和3.281，P=0.032和0.027），低剂量和高剂量蛇床子素组血管壁厚度减小，抑制了新生内膜的形成。见图1。

2.2 新生血管内膜中PCNA的表达

PCNA染色阳性细胞呈红色荧光。假手术组、模型组和高、低剂量蛇床子素组的PCNA表达指数分别为（20.1±1.2）%、（54.8±4.9）%、（28.3±3.9）%和（41.2±4.1）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=17.476，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，模型组与假手术组比较，差异有统计学意义（t=7.104，P=0.000），模型组新生平滑基层可见大量的阳性表达细胞；低剂量和高剂量蛇床子素组与模型组比较，差异有统计学意义（t=2.564和4.132，P=0.034和0.028），低剂量和高剂量蛇床子素组的新生平滑基层PCNA阳性细胞数较少。见图2。

图1 各组大鼠颈动脉 （HE）

图2 各组新生血管内膜中PCNA的表达 （×400）

2.3 受损血管TNF-α和IL-1β水平

各组TNF-α和IL-1β水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05），模型成立。模型组较假手术组大鼠血管TNF-α和IL-1β水平升高（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，低剂量蛇床子素组TNF-α和IL-1β水平低于模型组（P＜0.05）；高剂量蛇床子素组TNF-α和IL-1β水平低于模型组（P＜0.05）。见表1。

表1 各组受损血管TNF-α和IL-1β水平比较（pg/ml，±s）

表1 各组受损血管TNF-α和IL-1β水平比较（pg/ml，±s）

注：1）与假手术组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 TNF-α IL-1β假手术组（n =8） 38.7±4.2 22.5±2.5模型组（n =7） 103.8±5.21） 59.1±4.31）低剂量蛇床子素组（n =7） 83.5±8.12） 41.9±5.22）高剂量蛇床子素组（n =8） 56.2±5.32） 34.3±5.52）F值 74.080 34.424 P值 0.000 0.000

2.4 各组血管NF-κB和TLR4蛋白表达的变化

各组NF-κB和TLR4蛋白表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，模型组NF-κB蛋白表达水平较假手术组升高（P＜0.05）；不同剂量蛇床子素给药干预后，较模型组NF-κB蛋白表达水平降低（P＜0.05）。模型组TLR4蛋白表达水平较假手术组升高（P＜0.05）；而给予高、低剂量蛇床子素后，可抑制TLR4蛋白过表达（P＜0.05）。见表2和图3。

表2 各组血管NF-κB 和TLR4蛋白表达水平比较 （±s）

表2 各组血管NF-κB 和TLR4蛋白表达水平比较 （±s）

注：1）与假手术组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05

组别 NF-κB TLR4假手术组（n =8） 0.156±0.017 0.214±0.065模型组（n =7） 0.643±0.0181） 0.582±0.0601）低剂量蛇床子素组（n =7） 0.359±0.0202） 0.317 ± 0.0412）高剂量蛇床子素组（n =8） 0.282±0.0422） 0.257 ± 0.0432）F值 184.069 28.827 P值 0.000 0.000

图3 各组血管NF-κB和TLR4蛋白的表达

3 讨论

预防术后再狭窄是当前心血管病学研究领域所面临的重要课题之一。研究表明，球囊扩张对血管壁的直接损伤导致多种炎症应答、细胞生长因子的释放和血管平滑肌细胞的增殖、迁移、表型改变，以及血管内膜增生，共同造成术后再狭窄的发生[11-12]。本实验采用不同剂量蛇床子素治疗颈动脉球囊损伤大鼠。HE染色结果表明，模型组I/M比值高于假手术组，蛇床子素给药干预后，与模型组比较I/M比值降低，表明蛇床子素具有抑制内膜增生的作用。

PCNA只存在于正常增殖细胞和肿瘤细胞，参与细胞DNA的合成，反映细胞增殖状态。因此，通过其表达的高低可以间接反映血管平滑肌细胞的增殖情况。实验结果显示，模型组大鼠新生内膜中PCNA阳性表达指数最高，在蛇床子素组，新生内膜中PCNA阳性表达指数较模型组降低，说明蛇床子素通过抑制血管平滑肌细胞的增殖，从而降低新生内膜的增生。

TLR可以调控获得性免疫应答类，TLR4介导的炎症细胞发挥重要作用，其与增殖的血管平滑肌细胞参与动脉粥样硬化形成和再狭窄[13]。激活状态的TLR4可活化NF-κB，产生趋化因子和细胞因子，如IL-1β、TNFα[14-15]。NF-κB激活介导炎症级联反应，血栓形成，刺激炎症基因持续表达，促进TNF-α、IL-lβ的分泌，导致新生内膜形成，促使其增殖、迁移，最终导致血管壁发生病理改变。因此，有效控制炎症反应是控制术后再狭窄发生、发展的有效途径之一[16]。抑制TLR4/NF-κB激活便可有效阻止其介导的下游炎症反应，阻断其调节血管平滑肌细胞增殖。本研究结果发现，蛇床子素可以降低球囊损伤大鼠动脉血管TLR4/NF-κB的表达和炎症介质TNF-α、IL-lβ水平，进而延缓或减轻移植静脉再狭窄的病变程度。

总之，蛇床子素通过抑制TLR4/NF-κB的表达，减少炎症因子TNF-α和IL-1β的生成，抑制大鼠颈动脉球囊损伤后诱导的内膜增生、血管平滑肌细胞增殖。本研究为临床应用蛇床子素，预防术后再狭窄的发生提供了实验依据。