不同复合应激致卵巢早衰大鼠的SRB1、CYP2E1蛋白表达水平比较*

穆拉迪力·约麦尔，纳菲沙·卡德尔，阿卜力孜·克热木，夏米西努尔·伊力克

（新疆医科大学基础医学院，新疆 乌鲁木齐 830054）

卵巢早衰（premature ovarian failure, POF）指＜40岁女性因某种原因引起原发或继发性闭经、卵泡生成受阻等卵巢整体功能受损[1-3]。中医认为，在妇科病“外邪入侵”的众多致病因素中，寒、湿、热邪为主要原因，能够伤及中焦阳气，最终引起经络不通、水液代谢异常[4]。SRB1蛋白在胆固醇代谢平衡中起关键作用，卵巢组织中SRB1的异常表达导致体内胆固醇代谢异常。CYP2E1基因表达上调引起细胞毒素代谢增加，导致活性氧大量合成，最终卵巢功能受损[5]。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

通过阴道涂片筛选法（发情周期实验）选取性成熟的50只健康Wistar雌性大鼠（由新疆医科大学实验动物中心提供），体重（180±30）g。适应性饲养1周后，由于理论造模时间相差较大，随机分为POF组（A组）、热邪复合应激模型组（B组）、正常对照第1组（N1组），以及寒邪复合应激模型组（C组）、正常对照第2组（N2组）。各组10只大鼠。A组、B组、N1组模型复制时间10 d；C组、N2组模型复制时间21 d。

1.2 主要试剂及仪器

RXZ型人工气候箱（宁波市新江南仪器有限公司），兔多克隆抗体CYP2E1、兔单克隆抗体SRB1购自美国Abcam公司，顺氯氨铂（美国Sigma公司），大麦、芫荽籽、黑胡椒、干姜、西红花。

1.3 方法

1.3.1 POF大鼠模型的复制 按照LI等[6]的方法，将1.5 mg/kg顺氯氨铂稀释于1 ml生理盐水，每天下午2：00行腹腔注射，连续10 d。在（20±3）℃、相对湿度（relative humidity, RH）55%～65%条件下饲养大鼠。

1.3.2 中医寒邪复合应激致POF动物模型的复制 在杨宇琦等[7]报道的模型基础上做适当调整，采用干寒饲养环境[人工气候箱：（6±2）℃、RH 25%～35%，12 h/次，1次/d]，干寒属性饲料（大麦、芫荽籽）饲养。同时予以间断性足底电刺激、制动，冷水中强迫游泳等多因素复合作用，产生慢性应激，持续3周。

1.3.3 中医热邪复合应激致POF动物模型的复制

按照中医“热邪”证候特点[8]，结合寒邪模型复制方法，采用干热饲养环境[人工气候箱：（26±2）℃、RH 25%～35%，12 h/次，1次/d]，干热属性饮水（1 g西红花浸泡于500 ml双蒸水），干热属性药物灌胃（30.0 g黑胡椒、30.0 g干姜、0.3 g西红花溶解于500 ml双蒸水，按2 ml/100 g体质量灌胃，1次/d）。同时予以间断性足底电刺激、夹尾、噪音等多因素复合作用，产生体内刺激，持续10 d。

1.3.4 正常对照组 大鼠在（20±3）℃、RH 55%～65%条件下饲养，自由饮食。各组大鼠12 h昼/夜循环照明，定时观测生物学表征变化。

1.3.5 观察指标 模型复制成功后用10%水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，取卵巢组织，用4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片。

1.3.6 免疫组织化学法 每个样本随机选取10个视野，并保证各视野间完全不重叠。采用阳性细胞计数法，每组取7～10个不同样本，进行组间比较。阳性范围指阳性细胞所占百分率，分为5个等级：阳性范围＜5%计0分，6%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，＞75%计4分；着色强度指阳性细胞染色程度，分为4个等级：几乎不着色或有一点着色为0分，着色较浅为1分，着色较深为2分，着色很深为3分，最终得分=阳性范围评分×着色强度评分×25。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠SRB1蛋白表达水平比较

SRB1蛋白在卵巢组织的黄体细胞、卵泡膜细胞、细胞质中呈阳性表达，在细胞核和颗粒层细胞中呈阴性表达。N1组、N2组、A组、B组、C组大鼠的SRB1蛋白相对表达量分别为（92.86±34.50）、（97.22±44.10）、（246.88±73.72）、（200.00±35.36）、（182.14±40.09），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=18.734，P=0.000）。进一步两两比较经SNK-q检验，各模型组卵巢组织中SRB1蛋白表达水平较正常对照组升高（P＜0.05）；其中A、B组较N1组卵巢组织中SRB1蛋白表达变化率分别为166%和115%，差异有统计学意义（P=0.000）；C组较N2组卵巢组织中SRB1蛋白表达变化率为87%，差异有统计学意义（P=0.000）；A组与B组、A组与C组卵巢组织中SRB1蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组与C组卵巢组织中SRB1蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、2。

图1 SRB1在各组大鼠卵巢组织中的表达 （×100）

图2 各组大鼠卵巢组织中SRBI表达水平比较 （±s）

2.2 各组大鼠CYP2E1蛋白表达水平比较

CYP2E1蛋白在卵巢组织的黄体细胞、卵泡膜细胞、颗粒层细胞、细胞浆中呈阳性表达，在卵泡间质细胞中呈阴性表达。N1组、N2组、A组、B组、C组大鼠的CYP2E1蛋白相对表达量分别为（106.25±60.87）、（108.33±43.30）、（265.63±64.00）、（201.00±35.36）、（182.14±104.80），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=10.198，P=0.001）进一步两两比较经SNK-q检验，各模型组卵巢组织中CYP2E1表达水平较正常对照组升高（P＜0.05）；其中A、B组较N1组卵巢组织中CYP2E1蛋白表达变化率分别为150%和89%，差异有统计学意义（P=0.000）；C组较N2组卵巢组织中CYP2E1蛋白表达变化率为68%，差异有统计学意义（P＜0.05）；A组与B组、A组与C组卵巢组织中CYP2E1蛋白表达水平比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；B组与C组卵巢组织中CYP2E1蛋白表达水平比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图 3、4。

图3 CYP2E1在各组大鼠卵巢组织中的表达 （×100）

图4 各组大鼠卵巢组织中CYP2E1表达水平比较 （±s）

3 讨论

随着社会快速发展，引起POF的因素诸多，包括遗传因素、自身免疫、感染情况等[9]。由于POF病因复杂，尚无有效的治疗方法。西医多采用激素替代疗法（hormone replacement therapy, HRT）和促排卵疗法，即给予相应激素以补充机体雌激素不足[10-11]。HRT疗法具有疗程长、毒副作用强等特点，使患者患心脏病、子宫内膜癌等恶性疾病的风险加大。中医学者认为，肾虚是POF的病理学基础，病变涉及心、肝、脾、肺等器官，肺脏在妇科疾病的诊疗中经常被忽略，但肺与肾组织关系密切，肺阴虚损，亦可致肾阴不足。由于中医实验动物研究起步晚，不同中医体质异常所致的POF动物模型尚未成功复制，其生物学基础与发病机制需进一步从现代医学的角度进行研究。

SRB1是位于细胞表面的一种受体糖蛋白，分布广泛，主要在肝脏、肾上腺、卵巢等能生成类固醇激素的组织中高度表达。SRB1可以结合未被修饰过的LDL、VLDL等配体，对HDL有高亲和力，在HDL代谢中发挥关键作用。在细胞外膜上，SRB1能够调节疏水脂蛋白中脂类物质的选择性摄取，既能介导肝脏对HDL中胆固醇脂的选择性摄取，又能促进外周组织细胞内游离胆固醇转运至HDL，从而保持胆固醇代谢的平衡[12]。因此，POF的发生可能与体内胆固醇代谢有关，胆固醇代谢异常可能是热邪、寒邪导致POF的原因。CYP2E1是CYP450酶系中重要的亚型，在乙醇代谢中起关键作用。在高浓度乙醇条件下，随着CYP2E1蛋白表达上调，细胞毒素代谢增加，产生大量活性氧，引起氧化应激，导致细胞死亡[13]。CYP2E1升高还可引起炎症反应加重，可以级联引发其他炎症因子的活性升高，促进其他炎症因子表达。POF的发生还可能与细胞内有毒物质、活性氧，以及炎症因子的过度产生有关。

本研究结果表明，SRB1、CYP2E1蛋白在POF，以及热邪、寒邪复合应激模型大鼠卵巢组织中的表达水平有不同程度变化，POF组表达最高，其次为热邪和寒邪复合应激大鼠模型组，模型组与正常对照组有差异。寒邪、热邪复合应激模型与POF的发生关系密切。热邪、寒邪所致POF可能与体内胆固醇代谢异常及活性氧等物质的产生有关。