薯蓣丸对化疗4T1乳腺癌小鼠T淋巴细胞亚群的影响*

张雲杰，谢甦，赵大尉，关惠婷，胡雅清，张晨宇，贺昀

（1.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004；2.贵州医科大学附属医院，贵州 贵阳 550004；3.天津市失智老人康复照料中心，天津 300131；4. 广东省珠海市第二中医院，广东 珠海 519100）

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发生与转归严重影响女性的日常生活。化疗作为乳腺癌全身治疗中的重要一环被广泛应用于临床，但是在杀伤肿瘤的同时，对高度致敏的T细胞也有杀伤作用，并造成患者免疫力下降。前期研究发现，薯蓣丸可改善乳腺癌患者化疗期间的不良反应，提高免疫功能[1-2]。因此本实验进一步深入探索，通过复制4T1乳腺癌小鼠模型，以单纯化疗、化疗联合中药为干预手段，检测小鼠脾脏中 CD4＋、CD8＋、CD4＋CD25＋Foxp3＋调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）的表达水平，从薯蓣丸对化疗4T1乳腺癌小鼠T细胞亚群的影响，评价薯蓣丸对化疗后乳腺癌小鼠免疫功能的作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物 SPF级BALB/c雌性6周龄小鼠32只，体重（20±2）g，由贵州医科大学实验动物中心提供，生产批号：SCKK（黔）2015-0001，由贵州医科大学附属医院临床实验中心提供SPF级动物房。

1.1.2 实验细胞 4T1小鼠乳腺癌细胞株由中国科学院上海细胞库提供。

1.1.3 实验药品 ①薯蓣丸（中药），具体配方：大枣30 g，白蔹、干姜各3 g，防风、茯苓、生晒参、桔梗、杏仁、白术、芍药、麦门冬各5 g，大豆卷、柴胡、川芎、桂枝、阿胶各6 g，神曲、干地黄、当归各10 g，甘草18 g、薯蓣20 g，由北京同仁堂贵阳分店提供。按质量标准制成流浸膏于4℃冰箱存储。②多西他赛（化疗药物）由江苏奥赛康药业股份有限公司生产（生产批号：20150101），贵州医科大学附属医院提供。

1.1.4 实验试剂 培养基（型号：RPMI 1640）、胎牛血清购自美国Gibco公司，胰蛋白酶、磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline, PBS）购自北京索莱宝公司，Foxp3/Transcription Factor、Staining Buffer Set Kit试剂盒（美国eBioscience公司）。

1.1.5 实验仪器 EPICL XL型流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司），PM-10AD光学显微镜及照相系统（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组 随机将32只BALB/C雌性小鼠分为对照组、模型组、化疗组、中药组，各组8只。

1.2.2 4T1乳腺癌小鼠模型的复制 将4T1细胞株与完全培养基混悬（含90% RPMI 1640＋10%胎牛血清）后，置于5% CO2二氧化碳恒温细胞培养箱中，待细胞生长至80%～90%予以传代。取对数期的4T1乳腺癌细胞，使用台盼蓝拒染法检测细胞活力＞95%后，制备细胞浓度为1×107个/ml的细胞悬液。模型组小鼠左侧腹部注射0.1 ml细胞悬液，同时对照组小鼠左侧腹部注射0.1 ml生理盐水。约1周后即可形成约5 mm×5 mm肿块，取部分肿块组织进行苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining, HE）染色，镜下观察是否为肿瘤细胞。

1.2.3 实验动物给药 成瘤后第1天，中药组、化疗组小鼠按6.28 mg/kg的标准腹腔注射多西他赛（用注射用生理盐水定容至0.1 ml），1次/7 d，持续21 d[3]；模型组、对照组小鼠腹腔注射0.1 ml生理盐水，1次/7 d，持续21 d。首次注射化疗药物的次日，中药组给予0.3 ml薯蓣丸汤剂灌胃，其他组予以0.3 ml生理盐水灌胃，1次/d，持续21 d。

1.2.4 实验动物处死及组织取样 治疗完成后当晚小鼠禁食、未禁饮1 d。第2天将小鼠置于超净工作台颈椎脱臼处死，用无菌术器械取出小鼠脾脏，迅速置于3 ml缓冲液（PBS和1%胎牛血清混合液）中，于60 mm培养皿中轻研脾脏，研磨完毕后移去细胞筛，将混合液移入15 ml离心管中，置于冰上，配平后4℃、1 500 r/min离心5 min，去上清液。每管中加入1ml红细胞裂解液，静置5 min，加缓冲液至15 ml，4℃、1 500 r/min离心5 min，去上清液。加入1000μl缓冲液混悬，分为2管，各100μl，标记为A、B，每管1×105～1×108个细胞，备用。

1.2.5 流式细胞术 将CD4、CD8、CD25细胞表面分子进行染色，固定、破膜后染色细胞内Foxp3分子。每列样本均设A、B管，分别吸取收集好的淋巴细胞悬液100μl放入A、B管，每管分别加入0.500μl CD4 FITC、2.500μl CD8 PerCP、0.625μl CD25 APC，室温静置20 min，加入冷PBS 2ml混匀，1 500 r/min离心5 min，弃上清液。在A、B管中分别加入配好的固定液1 ml，边加边混匀，室温静置30 min。不需润洗，每管加入2 ml配好的缓冲液，1 500 r/min，5 min，弃上清。每管加入100μl缓冲液混悬，分别加入1.25μl Fox P3PE单抗及同型对照，室温静置20 min，加入2 ml缓冲液润洗后，1 500 r/min，5 min，弃上清。每管用500μl缓冲液混悬细胞，吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，两两比较用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤组织病理切片结果

大部分癌细胞为椭圆形或圆形，核浆比率较大，染色质、核仁染色较深，细胞分裂活跃，细胞排列无序，分化程度低。癌细胞表现为弥漫性片状实性分布，一小部分呈腺腔样，且浸入横纹肌及周围组织，伴部分坏死。说明所取组织为癌变组织，提示模型复制成功。见图1。

2.2 各组小鼠脾脏中 CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋水平比较

2.2.1 CD4＋4组小鼠脾脏中CD4＋细胞表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，模型组CD4＋表达量较对照组降低（P＜0.05），化疗组和中药组CD4＋表达量较模型组降低（P＜0.05），中药组CD4＋表达量较化疗组升高（P＜0.05）。见附表和图2。

图1 小鼠乳腺癌组织切片图 （HE×200）

2.2.2 CD8＋4组小鼠脾脏中CD8＋细胞表达水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，模型组CD8＋表达量较对照组降低（P＜0.05），化疗组和中药组CD8＋表达量较模型组降低（P＜0.05），但是化疗组与中药组CD8＋细胞表达水平比较，差异无统计学意义（P＜0.05）。见附表和图3。

2.2.3 CD4＋/CD8＋4组小鼠脾脏中 CD4＋/CD8＋水平比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较经LSD-t检验，模型组CD4＋/CD8＋比值较对照组降低（P＜0.05），化疗组和中药组CD4＋/CD8＋比值较模型组升高（P＜0.05），中药组 CD4＋/CD8＋比值较化疗组升高（P＜0.05）。见附表和图 2、3。

2.3 各组小鼠脾脏中 CD4＋ CD25＋ Foxp3＋ Treg细胞水平比较

对照组、模型组、化疗组、中药组小鼠脾脏 中 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg 表 达 水 平 分 别 为（6.28±1.54）%、（16.72±3.41）%、（12.77±1.30）%和（9.65±1.41）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=18.472，P=0.000）。进一步两两比较经LSD-t检验，模型组 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg表达量较对照组升高（P＜0.05），化疗组和中药组 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg表达量较模型组降低（P＜0.05），中药组 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg表达量较化疗组升高（P＜0.05）。见图 4。

附表 各组小鼠脾脏中CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋水平比较 （n =8，%，±s）

附表 各组小鼠脾脏中CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋水平比较 （n =8，%，±s）

注：1）与对照组比较，P ＜0.05；2）与模型组比较，P ＜0.05；3）与化疗组比较，P ＜0.05

组别 CD4＋ CD8＋ CD4＋/CD8＋对照组 24.69±3.74 13.36±1.60 1.85±0.19模型组 14.60±1.211） 12.19±0.791） 1.20±0.101）化疗组 10.56±1.121）2） 7.64±0.461）2） 1.39±0.181）2）中药组 12.49±0.291）2）3） 7.95±1.081）2） 1.59±0.211）2）3）F值 75.572 59.689 20.08 P值 0.000 0.000 0.000

图2 各组小鼠脾脏中CD4＋细胞表达水平

图3 各组小鼠脾脏中CD8＋细胞表达水平

图4 各组小鼠脾脏中CD4＋ CD25＋ Foxp3＋ Treg细胞含量

3 讨论

乳腺癌是一种严重影响女性身心健康，甚至危及生命的恶性肿瘤，是女性癌症死亡的首要原因。当前乳腺癌的治疗以手术为主，有序结合放化疗、内分泌治疗等方式进行综合治疗。其中化疗是最为有效和不可或缺的全身治疗手段之一，可以杀死肿瘤细胞，为乳腺癌进一步治疗提供前提条件，同时化疗也影响正常细胞，抑制细胞免疫功能，降低免疫力。

现代研究认为，机体免疫功能与肿瘤的发生、发展关系密切。细胞免疫是机体对抗肿瘤免疫的基本途径，其中T淋巴细胞是机体调节免疫反应中最主要的效应细胞，由功能各异的淋巴细胞亚群来发挥重要的调节作用，以CD4＋和CD8＋最为重要。CD4＋为辅助（Th）/诱导T细胞，可以辅助细胞免疫反应，通过抗原提呈细胞识别肿瘤细胞分泌的可溶性抗原，参与激活巨噬细胞分泌的IFN-γ或者激活NK细胞，促进抗体形成，B细胞的活化，并将各类免疫细胞聚集到肿瘤周围，杀伤MHCⅡ类抗原阴性肿瘤细胞，发挥抗肿瘤的作用。CD8＋T细胞主要为抑制T细胞（suppressor T cell, TS）和细胞毒性T细胞（cytotoxic T cell, CTL）。TS细胞直接阻断肿瘤细胞与淋巴细胞表面相对应的受体的结合，削弱机体对肿瘤细胞的免疫反应，同时TS细胞还可分泌一些免疫抑制因子，实现对机体免疫反应的抑制作用。与TS细胞不同，CTL是机体抵抗肿瘤细胞、病毒感染的重要效应细胞，能够利用不同渠道对肿瘤细胞产生影响，比如分泌能介导细胞溶解或凋亡的TNF-α、IFN-γ等细胞因子。研究发现，在肿瘤周围不仅浸润大量的CD4＋、CD8＋T细胞，还浸润大量的 Treg细胞，主要为 CD4＋CD25＋Treg细胞[4-7]。CD4＋CD25＋Treg细胞是一群具有免疫无能、免疫抑制及免疫调节等特点的T细胞亚群，通过发挥免疫抑制作用和调节其他免疫细胞来维持机体内环境的稳定[8-10]。CD4＋CD25＋Treg细胞的特异性标志物为双叉头状的转录因子Foxp3，其能为CD4＋CD25＋Treg细胞的发育和免疫抑制功能提供重要条件，不仅是CD4＋CD25＋Treg细胞发育的一个重要开关，也是介导CD4＋CD25＋Treg细胞免疫抑制功能的关键因素[11-12]，可通过某种途径调节肿瘤细胞的生长、转移。

在免疫功能正常的人群中，CD4＋/CD8＋比值处于一种动态平衡[13-14]，CD4＋CD25＋Treg细胞亦相对稳定，各自发挥作用。一旦患者罹患恶性肿瘤，这些动态平衡都将发生改变，具体表现为CD4＋细胞的减少，CD8＋细胞略升高、正常或略降低（由Ts细胞相对增加，CTL细胞相对减少造成），CD4＋CD25＋Treg细胞增多，这些改变促使机体监视肿瘤细胞功能下降，引起肿瘤细胞的生长、逃逸与转移[15]。有研究表明，CD4＋/CD8＋比值下降将降低患者远期生存率，Treg细胞升高可以引起肿瘤细胞的逃逸与转移，因此本实验选用这几个指标观察薯蓣丸对乳腺癌小鼠化疗后免疫功能的影响。4T1乳腺癌小鼠模型复制成功后，免疫功能下降，化疗后加剧了该状态，而薯蓣丸能有效提高小鼠的免疫功能；化疗组和中药组CD8＋水平无明显下降趋势，可能与CD8＋细胞分类有关。4T1乳腺癌小鼠模型复制成功后，脾脏中CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞表达水平升高，增加了肿瘤细胞逃逸的可能性；化疗的全细胞毒性作用降低了CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞表达水平，减少肿瘤细胞逃逸的可能性，化疗联合中药治疗对CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞作用效果更优。

中医学将乳腺癌归为“乳岩、乳癖”范畴，提出“正气虚为岩”，认为正气不足，气血亏虚，脏腑功能失调是乳岩发生的前提和决定因素，有形之邪盘踞于体内，耗伤气血，瘀阻经络，日久则气血阴阳俱虚，属本虚标实之证。化疗为火热药毒之邪，加重了其本虚标实的证候，因此正气不足、气血亏虚、虚实夹杂、易感外邪这一病因、病机始终贯穿在乳腺癌化疗患者的病程中。薯蓣丸是仲景扶正祛邪，治疗虚劳性疾病的名方，主治“虚劳诸不足，风气百疾”，与乳腺癌病机极为相似，故临床上可选用薯蓣丸为乳腺癌化疗期间的基础方。薯蓣丸以薯蓣为君药，薯蓣之性不寒不热，能健脾养胃，使脾胃健运，气血生化有源；人参、白术、茯苓、甘草益气健脾；干姜、大枣甘温扶脾阳；当归、川芎、芍药、熟地养血和血，与大枣相合共治血虚；阿胶、麦冬滋阴；用桂枝可去太阳之邪，柴胡去少阳之邪，防风去阳明之邪，余邪可散；神曲消食健脾，以消食积；桔梗合柴胡使气机升，白蔹和杏仁使气机降，则气机之升降出入可恢复。诸药配伍，补中寓散，补虚而不敛邪，祛邪不伤正。在前期临床实验中，发现薯蓣丸可在一定程度上缓解化疗后乳腺癌患者的临床症状，改善骨髓抑制，提高免疫功能[1-2]。

综上所述，薯蓣丸可以提高化疗4T1乳腺癌小鼠CD4＋、CD4＋/CD8＋细胞表达水平，降低 CD4＋CD25＋Foxp3＋Treg细胞表达水平，改善化疗后乳腺癌小鼠免疫功能。