天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠血管内皮细胞自噬相关信号通路Ca2+/AMPK/mTOR的影响

李云攀，刘美云

(1.潍坊护理职业学院，山东 潍坊 262500；2.山东省潍坊市益都中心医院，山东 潍坊 262500)

高血压是一种常见的严重危害人类身体健康的心血管疾病，其发病率和病死率逐年增加，呈年轻化趋势显著，给患者造成极大的医疗负担[1]。相关研究表明，血管内皮功能障碍是诱发和加重高血压病的重要分子机制，在高血压病理状态下，血管活性物质和炎症介质等因素长期刺激血管壁，导致血管内皮细胞外基质异常降解和沉积、抗凝和促凝功能紊乱、血管收缩因子和血管舒张因子调节失衡，最后引发血管内皮功能障碍[2-4]。

此外，有文献报道自噬与血管内皮细胞功能密切相关，其对内皮细胞增殖、黏附、分泌及血管形成等功能方面发挥着至关重要的作用[5-7]，而自噬是一把双刃剑，基础水平自噬能有效保护内皮细胞功能与结构受损，但自噬过度激活反而会加重高血压病情。目前，中药对高血压自噬影响的文献报道甚少，且血管内皮功能障碍与高血压自噬之间的发生机制亦未见相关实验研究，因此，本文拟采用自发性高血压模型大鼠，初步探讨天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠血管内皮细胞自噬相关信号通路Ca2+/AMPK/mTOR的影响，以阐述其降压机制与调控自噬的相关性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性SPF级京都种大鼠(wistarkyoto rat,WKY)10只、自发性高血压大鼠(spontaneous hyertensive rat,SHR)30只，体重180～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物质量合格证号为SCXK(京)2012-0001。

1.1.2 药物 天麻钩藤饮由天麻9 g、钩藤12 g、生决明18 g、黄芩9 g、栀子9 g、川牛膝12 g、桑寄生9 g、朱茯神9 g、杜仲9 g、夜交藤9 g、益母草9 g组成，统一购自北京同仁堂大药房并符合国家药典标准，尼莫地平片购自天津市中央药业有限公司。

1.1.3 试剂 RIPA蛋白抽提试剂、HRP-山羊抗兔IgG二抗购自武汉博士德生物工程有限公司，Trizol试剂购自美国Invitrogen公司，大鼠ANGⅡ、IL-1 ELISA kit购自武汉博士德生物工程有限公司，大鼠CaM ELISA kit购自武汉华美生物科技有限公司，兔抗大鼠Beclin-1、LC3-Ⅱ、腺苷酸活化蛋白酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)多克隆抗体购自美国Proteintech公司，其余常用试剂均为市场分析纯。

1.1.4 仪器 BP98A型无创血压检测仪(北京软隆科技有限责任公司)，GS-800型凝胶扫描成像系统(美国Bio-Rad公司)，LA612型超纯水仪(美国Elga公司)，PowerPac型电泳仪(美国Bio-Rad公司)，5427R型台式高速冷冻离心机(德国Eppendoff公司)。

1.2 方法

1.2.1 分组及给药 将30只雄性SHR大鼠按体重随机分为SHR组、尼莫地平组及天麻钩藤饮组，另设正常对照组(WKY组)，每组10只。参照文献[8]并按体表面积与人临床等效剂量换算，中药组大鼠灌胃给予天麻钩藤饮生药10.26 g/kg，西药组大鼠灌胃给予尼莫地平5.4 mg/kg，WKY组和SHR组大鼠则给予等量蒸馏水，灌胃体积为10 ml/kg，1次/d，连续给药6周。

1.2.2 大鼠血压检测 采用BP98A型无创血压仪检测各组大鼠尾动脉收缩压，在清醒与非激怒状态下，取连续3次大鼠尾动脉收缩压的平均值作为其血压，所有大鼠首次给药前测定血压，然后每隔2周于给药1 h后测量血压，并固定每次测量时间均在上午。

1.2.3 血浆血管紧张素Ⅱ、白细胞介素1、钙调素含量检测 各组动物给药6周后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，肝素钠抗凝，3 000 r/min离心10 min，收集血浆，采用酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测各组大鼠血浆中ANGⅡ(AngiotensinⅡ,ANG Ⅱ)、IL-(1Interleukin-1,IL-1)及CaM含量(Calmodulin,CaM)，具体操作步骤详见ELISA试剂盒说明书。

1.2.4 自噬标志物、微管相关蛋白轻链检测 各组动物给药6周后，4%水合氯醛腹腔注射麻醉，即刻分离胸主动脉，置于离心管中，加入PMSF-RIPA(1︰100)试剂抽提总蛋白，12 000 r/min离心10 min，取上清，BCA试剂盒检测自噬标志物(autophagy-related,Beclin-1)和微管相关蛋白轻链(microtubule-associated protein Ⅱ light chain-3,LC3-Ⅱ)蛋白含量。将蛋白样本与上样缓冲液混匀、变性后，以每孔60 μg加入至SDS-PAGE凝胶中，电泳、转膜2.5 h，于摇床5% BSA室温封闭1 h。加入一抗(Beclin 11︰1 000，LC3-Ⅱ1︰1 000，GAPDH 1︰1 000)4℃培养过夜，TBST洗3次×10 min，加入HRP-山羊抗兔二抗(1︰1 000)，室温振摇培养1 h，TBST洗4次×10 min，ECL化学发光后通过蛋白印迹成像和定量分析系统进行扫描，并计算各蛋白的相对光密度值。

1.2.5 自噬通路相关AMPK和mTOR蛋白检测 同上操作抽提总蛋白后，离心、取上清，BCA试剂盒测定AMPK和mTOR蛋白含量，蛋白样本与上样缓冲液混合、变性，每孔60μg加入SDS-PAGE凝胶中，电泳、转膜3 h，5% BSA封闭1 h，加入一抗(AMPK 1︰1 000，mTOR 1︰1 000，GAPDH 1︰1 000)4℃培养过夜，TBST洗3次×10 min，加入HRP-山羊抗兔二抗(1︰1 000)，室温振摇培养1 h，TBST洗4次×10 min，ECL化学发光，最后采用蛋白印迹成像和定量分析系统计算各蛋白的相对光密度值。

1.2.6 自噬通路相关AMPK和mTOR基因检测 取各组大鼠胸主动脉，分别加入Trizol试剂，参照试剂盒步骤抽提总RNA，采用核酸定量仪测定其浓度及纯度。进行逆转录聚合酶链反应合成cDNA:42℃60 min、75℃ 5 min，然后扩展基因产物:95℃预变性35 s，95℃变性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸60 s，共40次循环。其中内参β-actin引物序列正向引物:5'-CATCGCTTGCGGCAGTCACCTG-3'，反向引物:5'-CGTACTGCGTGCGATGAGTCACTT-3'；AMPK引物序列正向引物:5'-CGACGTGGAGCTGTACTGACGT-3'，反向引物:5'-CATACTCAGTCAGATCTCTATC-3'；mTOR引物序列为正向引物:5'-TCGAGTGTTAGCCAC TATAG-3'，反向引物:5'-CCTATTATCGACGCATCCG A-3'。最后以内参为对照计算各基因的相对表达量。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPFF 16.0统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，不同时间点的各组大鼠尾动脉收缩压的比较采用重复测量设计的方差分析，组间两两比较采用t检验，多组间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 天麻钩藤饮对SHR大鼠血压的影响

4组大鼠给药前、给药2周、给药4周及给药6周后的血压值比较采用重复测量设计的方差分析，结果:①不同时间点的血压值有差异(F=42.282，P=0.000)；②不同组之间的血压值有差异(F=10.518，P=0.004)；③不同组之间的血压值变化趋势有差异(F=217.009，P=0.000)。给药2、4和6周后，与相应时间点WKY组比较，SHR组大鼠血压增高(t=22.822、31.183和32.482，P=0.009、0.005和0.005)；与相应时间点SHR组比较，尼莫地平组大鼠血压降低(t=14.342、40.932和20.683，P=0.019、0.003和0.010)，天麻钩藤饮组大鼠血压亦降低(t=9.226、11.389和13.494，P=0.039、0.028和0.021)，这提示天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠具有降压作用。见表1。

2.2 天麻钩藤饮对SHR大鼠血浆ANGⅡ、IL-1及CaM水平的影响

ELISA检测结果显示，给药6周后，4组大鼠血浆ANGⅡ、IL-1及CaM水平比较，差异有统计学意义(F=16.073、10.052和28.712，P=0.001、0.004和0.000)；与WKY组比较，SHR组大鼠血浆中ANGⅡ、IL-1及CaM含量均增加，差异有统计学意义(t=44.280、25.230和68.112，P=0.000、0.001和0.000)，与SHR组比较，尼莫地平组大鼠血浆ANGⅡ、IL-1及CaM水平均降低(t=18.819、10.415和41.320，P=0.001、0.004和0.000)，天麻钩藤饮组大鼠上述3个因子水平亦降低(t=13.374、9.574和7.711，P=0.003、0.009和0.008)，这提示天麻钩藤饮能有效降低SHR大鼠炎症水平、抑制血管内皮因子过度激活和细胞内钙增加。见表2。

表1 天麻钩藤饮对SHR大鼠尾动脉收缩压的影响(n =10，mmHg，±s)

表1 天麻钩藤饮对SHR大鼠尾动脉收缩压的影响(n =10，mmHg，±s)

注:1)与WKY组比较P ＜0.05；2)与SHR组比较P ＜0.05

组别给药前给药2周给药4周给药6周SHR组166.2±9.61)182.7±14.31)185.6±11.71)191.5±13.61)尼莫地平组(5.4 mg/kg)167.9±10.41)141.6±12.22)131.3±8.92)145.9±10.82)天麻钩藤饮组(10.26 g/kg)169.1±11.31)152.1±10.02)156.6±9.22)154.0±11.32)WKY组127.7±8.5135.5±9.4138.4±8.8137.1±9.4

表2 天麻钩藤饮对SHR大鼠血浆ANGⅡ、IL-1及CaM水平的影响 (n =10，pg/ml，±s)

表2 天麻钩藤饮对SHR大鼠血浆ANGⅡ、IL-1及CaM水平的影响 (n =10，pg/ml，±s)

注:1)与WKY组比较P ＜0.05；2)与SHR组比较P ＜0.05

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2.3 天麻钩藤饮对自噬标志物Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，给药6周后，SHR组大鼠血管内皮细胞中自噬标志物Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达与WKY组比较差异有统计学意义(t=29.897和27.396，P=0.005和0.006)，SHR组上调，表明SHR大鼠血管内皮细胞中自噬被激活；尼莫地平组大鼠自噬标志物Beclin-1蛋白表达与SHR组比较，差异有统计学意义(t=8.824，P=0.041)，尼莫地平组降低；天麻钩藤饮组大鼠Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达均降低(t=22.615和18.340，P=0.009和0.013)，这提示天麻钩藤饮能有效降低SHR大鼠自噬水平。见图1。

2.4 天麻钩藤饮对AMPK和mTOR表达的影响

图1 天麻钩藤饮对血管内皮细胞自噬标志物Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达的影响

Western blot检测结果显示，给药6周后，WKY组与SHR组大鼠血管内皮细胞中自噬通路AMPK和mTOR比较，差异有统计学意义(t=252.150和47.040，P=0.000和0.002)，SHR组表达上调；与SHR组比较，尼莫地平组大鼠自噬通路相关AMPK和mTOR蛋白表达降低(t=43.320和18.732，P=0.003和0.012)，天麻钩藤饮组大鼠AMPK和mTOR蛋白表达亦降低(t=147.001和21.689，P=0.000和0.009)，这提示天麻钩藤饮对自噬通路相关AMPK和mTOR蛋白具有调控作用。见图2。

2.5 天麻钩藤饮对自噬通路相关AMPK和mTOR基因表达的影响

RT-PCR检测结果显示，给药6周后，4组大鼠AMPK和mTOR基因表达水平比较，差异有统计学意义(F=10.482和8.126，P=0.004和0.008)；WKY组与SHR组大鼠血管内皮细胞自噬通路相关AMPK和mTOR mRNA比较，差异有统计学意义(t=26.113和22.601，P=0.001和0.002)，SHR组表达上调；与SHR组比较，尼莫地平组大鼠自噬通路相关AMPK和mTOR mRNA表达均降低(t=14.530和9.125，P=0.003和0.011)，天麻钩藤饮组大鼠上述两基因表达水平亦降低(t=7.769和9.654，P=0.011和0.008)，这提示天麻钩藤饮对自噬通路相关AMPK和mTOR基因具有明显的调控作用。见表3。

图2 天麻钩藤饮对血管内皮细胞自噬通路相关AMPK和mTOR蛋白表达的影响

表3 天麻钩藤饮对血管内皮细胞自噬通路相关AMPK、mTOR基因表达的影响 (n =10，±s)

表3 天麻钩藤饮对血管内皮细胞自噬通路相关AMPK、mTOR基因表达的影响 (n =10，±s)

注:1)与WKY组比较P ＜0.05；2)与SHR组比较P ＜0.05

组别AMPKmTOR SHR组1.637±0.2721)1.432±0.1871)尼莫地平组(5.4 mg/kg)0.924±0.1762)1.015±0.1492)天麻钩藤饮组(10.26 g/kg)1.073±0.2212)0.987±0.1632)WKY组0.729±0.1440.842±0.106

3 讨论

自噬是指细胞内受损、变性及衰老的蛋白和细胞碎片被运输到溶酶体，并对其进行消化降解，以胞质内自噬体出现为标志的一种程序化的细胞自我降解过程[9]。在此过程中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白是哺乳动物自噬相关基因的编码产物，两者通过与哺乳动物空泡序列蛋白质34(mammalian Vacuolar sorting proteins-34,mVps-34)、B细胞淋巴瘤蛋白2(B Cell Leukemia-2,Bcl-2)等因子相互作用，激活细胞自噬，故Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白常常作为自噬标志分子来检测细胞自噬水平[10]。相关研究发现，血管内皮功能障碍与高血压病的发生密切相关，并且是后者的重要致病因素，在高血压病理进程中，血管内皮细胞与循环血液内高浓度的AngⅡ直接接触，刺激产生大量活性氧(reactive oxygen species,ROS)、IL-1、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎症因子及细胞内钙离子[11-12]，而当Ca2+超载后，血浆中钙调素CaM增加，又可激活钙/钙调蛋白激酶依赖性激酶β(Ca2+/calmodulin-dependent kinase kinase β，CaMKK-β)增加AMPK活性，然后磷酸化结节蛋白复合物2(tuberous sclerosis complex-2,TSC-2)进而抑制重组人表皮因子(reconstructed human epidermis,RHE)分子，通过负反馈抑制mTOR活性，最终激活细胞自噬[13-15]，因此自噬与高血压发病机制密切相关，其可通过Ca2+/AMPK/mTOR信号途径导致血管内皮细胞坏死与凋亡，进而加重高血压病情。

天麻钩藤饮源自《杂病证治新义》，是目前临床上一种治疗高血压病的经典方，由天麻、钩藤、生决明、黄芩、栀子、川牛膝、桑寄生、朱茯神、杜仲、夜交藤、益母草几味药组成，方中天麻、钩藤平肝熄风，石决明平肝潜阳，黄芩、栀子清肝降火，川牛膝活血利水，桑寄生、杜仲补肝益肾，朱茯神、夜交藤宁心安神，诸药合用，共奏平肝熄风、清热活血、补益 肝肾之功效[8，16]。临床研究表明，其降压效果显著，并能抑制患者细胞内Ca2+释放、降低血浆内皮素(Endothelin,ET)、ANGⅡ含量及超敏C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、TNF-α等炎症因子水平，有效改善高血压患者受损的血管内皮功能及血管重塑[17]。本文实验研究结果发现，尼莫地平、天麻钩藤饮均能降低SHR大鼠尾动脉收缩压和血浆ANGⅡ和CaM水平、下调血管内皮细胞中自噬标志物Beclin-1和LC3-Ⅱ与自噬通路相关AMPK和mTOR蛋白及mRNA表达水平，这些结果提示抑制自噬相关信号通路与天麻钩藤饮降压机制存在一定的联系。已知阳性药尼莫地平属于钙通道拮抗剂，研究表明其能有效降低SHR大鼠血压[18-19]，且尼莫地平可通过阻断Ca2+/AMPK/mTOR信号通路从而抑制细胞自噬[20]，这提示天麻钩藤饮可能也是通过调控Ca2+/AMPK/mTOR相关自噬信号通路而发挥降压作用的。

综上所述，天麻钩藤饮对自发性高血压大鼠血管内皮细胞自噬相关信号通路Ca2+/AMPK/mTOR具有明显的调控作用，其中药整体降压作用与调控自噬密切相关，推测天麻钩藤饮通过降低ANGⅡ、IL-1等血管活性与炎症介质，然后抑制细胞内钙超载，继而阻断Ca2+/AMPK/mTOR自噬信号途径，这可能是天麻钩藤饮抑制血管内皮细胞自噬发挥降压作用的重要机制之一，但其具体机制仍有待明确，后续实验计划采用AMPK、mTOR受体阻断剂与激动剂，并从药物不同作用时间点对其进行更深层次的机制研究。