SIRT1通过降低NF-kB p65表达减轻异烟肼致人肝细胞损伤的研究*

[华北理工大学公共卫生学院(河北省煤矿卫生与安全重点实验室)，河北 唐山 063000]

异烟肼(Isoniazid,INH)是抗结核治疗的一线药物，其主要副作用是抗结核药物性肝损伤(antituberculosis drug-induced liver injury,ADLI)[1]。目前认为异烟肼药物代谢引起的炎症反应在肝损伤发生过程中起重要作用，并可能成为ADLI防治的重要靶点[2]。

组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)作为催化核心组蛋白和非组蛋白发生去乙酰化作用的重要酶类物质，在调控细胞生长、参与氧化应激反应及炎症基因表达等方面发挥着重要功能[3-4]。沉默信息调节因子1(SIRT1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖性的Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶，与细胞衰老、抗氧化应激以及抑制炎症等细胞多种功能活动有关[5]。近年来有研究表明，转化生长因子1(TGF-β1)在肾小球系膜细胞中发挥作用的过程中，沉默SIRT1可使TGF-β1诱导的纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原和细胞外基质的表达及Smad3的乙酰化水平增加；加入白藜芦醇能够激活SIRT1，使其与Smad3结合而增加Smad3的去乙酰化水平，进而抑制Smad3表达，减轻肾脏纤维化的发生[6]。另外，NF-kB是SIRT1的靶分子，故推测在异烟肼致肝损伤过程中由NF-kB介导的促炎症反应增强也可能与SIRT1的表达变化有关。

本研究通过异烟肼刺激人正常肝细胞，观察在异烟肼致肝细胞损伤过程中SIRT1的表达变化，并通过加入SIRT1的激动剂和抑制剂影响SIRT1表达，观察其对炎症因子的影响，从而探讨SIRT1在异烟肼致人肝细胞损伤中的调控作用，为ADLI的预防和结核病患者的高效保肝治疗研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人正常肝细胞株HL-7702引自上海中科院细胞所，异烟肼(批号:YSMXE-OM)、二甲基亚砜(批号:W3OKK-MI)购自日本TCI公司，青霉素与链霉素(批号:1634678)购自德国BI公司，0.25%胰蛋白酶(批号:25200-072)购自美国Gibco公司，SIRT1激动剂SRT1720(批号:S112906)、抑制剂EX527(批号:S154103)购自美国Selleck公司，Prime ScriptTMRT Master Mix试剂盒(批号:AK4601)、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ PCR试剂盒(批号:AK4602)购自大连宝生物工程有限公司，TRI pure Reagent 总RNA抽提试剂盒(批号:0020161010)购自北京百泰克生物技术有限公司，ALT、AST试剂盒(批号:20170301)购自南京建成生物工程研究所，SIRT1、NF-kB p65、TNF-α ELISA检测试剂盒(批号:201612)购自北京冬歌伟业生物技术有限公司，IL-6 ELISA检测试剂盒(批号:210660124)购自杭州联科生物技术有限公司，Heraeus高速冷冻离心机购自德国Thermo Scientific公司，CA94089型连续光谱酶标仪购自美国Molecular Devices公司，C1000PCR扩增仪购自美国Bio-Rad公司，实时荧光定量聚合酶链反应(qRTPCR)仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.2 细胞培养

用含90% RPMI 1640(批号:24916002，美国CORNING公司)、10%胎牛血清(批号:JC50166，美国CLARK公司)、1%双抗的培养液作为HL-7702细胞的培养基，将细胞放置于浓度为5%的二氧化碳、37oC的细胞培养箱中进行培养。取对数生长期细胞，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种到6孔板上，每孔为2 ml。接种预培养24 h后更换培养基并给予相应处理，再次培养48 h后分别收集细胞及上清液。

1.3 细胞分组及干预

实验按以下分组处理:空白对照组(1640培养基)、异烟肼组(含800 μg /ml异烟肼的1640培养基，INH)、异烟肼+SIRT1激动剂组(含800 μg/ml异烟肼和1 μmol /L SIRT1激动剂SRT1 720的1640培养基，INH+SRT1 720)、SIRT1激动剂对照组(含1 μmol/L SIRT1激动剂SRT1 720的1640培养基，SRT1 720)、异烟肼+SIRT1抑制剂组(含800 μg/ml异烟肼和1 μmol/L SIRT1抑制剂EX527的1640培养基，INH+EX527)、SIRT1抑制剂对照组(含1 μmol/L SIRT1抑制剂EX527的1640培养基，EX527)。

1.4 细胞上清液中ALT、AST含量检测

收集细胞培养的上清液，严格按照商品化的丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)检测试剂盒说明书进行操作，测定各指标含量。

1.5 肝细胞中SIRT1、NF-kB p65 mRNA表达水平的检测

采用qRT-PCR方法检测肝细胞中SIRT1、NF-kB p65 mRNA表达水平。收集细胞用Trizol提取RNA，检测并计算RNA的纯度和浓度；取RNA在逆转录酶的作用下合成cDNA。利用SYBR Green嵌合荧光法进行实时PCR扩增。逆转录、qRT-PCR技术严格参照试剂盒说明书进行操作。逆转录条件为37oC 15 min，85oC 5 s，4oC 1 min。mRNA表达水平的检测以GAPDH为内参，反应条件:95oC 30 s，95oC 5 s，60oC 30 s共40个循环，荧光引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司负责设计与合成。引物序列如下:GAPDH正向引物5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'，反向引物5'-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3'；SIRT1正向引物5'-CATAGACACGCTGGAACAGG-3'，反向引物5'-TTGAGGGAAGACCCAATAACA-3'；NF-kB p65正向引物5'-GCGAGAGGAGCACAGATAC C-3'，反向引物5'-GCACAGCATTCAGGTCGTAG-3'。采用2-ΔΔCt计算mRNA表达水平。

1.6 肝细胞中SIRT1、NF-kB p65、IL-6、TNF-α蛋白表达水平的检测

采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测肝细胞中SIRT1、NF-kB p65、IL-6、TNF-α蛋白表达水平，严格参照试剂盒的说明书进行操作。

1.7 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，采用单因素方差分析比较各组间的差异，两两比较用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞上清液中ALT和AST含量的比较

异烟肼诱导引起HL-7702细胞上清液ALT、AST含量增加，与空白对照组比较差异有统计学意义(q=22.490和17.330，均P=0.000)，表明异烟肼组肝细胞发生损伤。SIRT1激动剂对照组和抑制剂对照组与空白对照组差异无统计学意义(P＞0.05)，提示激动剂和抑制剂对培养的人肝细胞无毒作用。异烟肼组之间比较，异烟肼+SIRT1激动剂组ALT、AST含量降低，异烟肼+SIRT1抑制剂组则进一步升高，差异有统计学意义(q=9.951、20.234、12.908和16.741，均P=0.000)，表明SIRT1激动剂的加入减轻异烟肼引起的肝细胞损伤而SIRT1抑制剂的加入进一步加重了肝细胞损伤的发生。见附表。

附表 各组细胞上清液中ALT和AST含量的比较(u/L，±s)

附表 各组细胞上清液中ALT和AST含量的比较(u/L，±s)

注:1)与空白对照组比较，P ＜0.05；2)与异烟肼组比较，P ＜0.05

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2.2 激动剂SRT1720对SIRT1的激动作用

异烟肼刺激造成HL-7702细胞的SIRT1 mRNA和蛋白表达降低，NF-kB p65的mRNA和蛋白及TNF-α、IL-6的蛋白表达升高，与空白对照组比较差异有统计学意义(q=2.564、15.132、5.582、11.431、14.816和16.318，P=0.019、0.000、0.002、0.000、0.000和0.000)，提示异烟肼组细胞发生了炎症反应。激动剂对照组与空白对照组炎症因子表达的差异无统计学意义(P＞0.05)，提示激动剂对细胞无毒作用。SIRT1激动剂SRT1720的联用可以抑制异烟肼刺激引起的NF-kB p65 mRNA和蛋白及TNF-α、IL-6蛋白表达上升，与异烟肼组比较差异有统计学意义(q=2.849、7.581、9.081和16.528，P=0.012、0.000、0.000和0.000)，提示SIRT1的激活可以通过降低NF-kB p65表达进而减少IL-6、TNF-α表达，减轻异烟肼引起的炎症反应。见图1～3。

2.3 抑制剂EX527对SIRT1的抑制作用

SIRT1抑制剂EX527的联用可引起NF-kB p65 mRNA和蛋白及TNF-α、IL-6蛋白表达进一步上升，与异烟肼组比较差异有统计学意义(q=2.736、8.142、8.917和18.454，P=0.015、0.000、0.000和0.000)，说明SIRT1的抑制可以通过增加NF-kB p65表达进而使TNF-α、IL-6表达上升，加重异烟肼导致的炎症反应。抑制剂对照组与空白对照组炎症因子表达的差异无统计学意义(P＞0.05)，提示抑制剂对细胞无毒作用。见图4～6。

图1 各组SIRT1、NF-kB p65的mRNA表达

图2 各组SIRT1、NF-kB p65的蛋白表达

图3 各组IL-6、TNF-α的蛋白表达

图4 各组SIRT1、NF-kB p65的mRNA表达

图5 各组SIRT1、NF-kB p65的蛋白表达

图6 各组IL-6、TNF-α的蛋白表达

3 讨论

随着抗结核药物性肝损伤研究的深入，越来越多的研究发现药物代谢引起的炎症反应在其发生发展过程中起着重要作用，但由于其机制十分复杂，目前为止尚不明确其损伤作用。NF-kB是1个蛋白二聚体，由p50、p65 两种蛋白亚基组成，它存在于多种细胞中且是细胞中多条信号通路的汇集点，并在炎症的发生、发展中具有至关重要的作用[7]。研究表明，NF-kB的高表达与肝脏疾病的发病密切相关:在运用活性氧诱导肝细胞癌的过程中会使NF-kB表达增加，而刺激活性氧增加会使NF-kB表达进一步增加，从而促进肝细胞癌的发生，这提示在肝癌发生的过程中，NF-kB可能起着重要作用[8]；此外，使用抗炎药物治疗胆汁淤积性肝损伤的大鼠，NF-kB水平会随着治疗时间延长而明显下降，这同样表明其与肝脏疾病的关系十分密切[9]。课题组前期研究发现，异烟肼致小鼠肝损伤发生过程中，NF-kB通路被激活，促炎因子TNF-α过量产生[10]。本研究结果显示，异烟肼引起的肝细胞损伤中NF-kB p65的表达升高，炎症因子IL-6、TNF-α也随之表达上升，进一步提示药物代谢引起的炎症反应在ADLI发生过程中的重要作用。

SIRT1作为一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的组蛋白去乙酰化酶，能够调控多种蛋白质发生去乙酰化，从而参与到基因表达调控及机体免疫炎症反应等许多生物学功能的调控过程中。例如应用丹酚酸B上调SIRT1表达，使p53去乙酰化水平增加，进而抗氧化酶活性提高，致乙醇诱导的急性肝损伤程度减轻[11]。另有研究发现，在代谢相关的肝癌小鼠模型中，上调SIRT1表达，肝癌的发生率可明显降低，并且SIRT1表达升高后，也会明显降低肝脏的高脂损伤[12]。本研究结果显示SIRT1在异烟肼致人正常肝细胞损伤的过程中呈低表达状态，提示其可能参与到异烟肼致人正常肝细胞损伤的过程中。

研究证实SIRT1可以通过调控炎症因子的表达情况，进而参与到机体免疫系统调节肿瘤发生和发展的过程中[13-14]。SIRT1抑制炎症反应的相关机制目前并不十分清楚，但大多数观点认为它与抑制炎症信号通路有关。其中，研究最多的是SIRT1对NF-kB信号通路的抑制作用。早有研究指出，SIRT1表达水平的异常可以引起NF-kB信号通路的紊乱，进而导致抗炎功能的紊乱[15]。近年来有研究发现，NF-kB p65亚单位自身需要经过一系列的修饰才可发挥它转录因子的功能，其中乙酰化修饰是其最重要的修饰途径之一[16]。有研究证实，SIRT1可使NF-kB的亚基RelA/p65去乙酰化，致NF-kB表达减少，这可能阻止了炎症反应发生及随后的心肌重构[17]。WANG等[18]研究发现，SIRT1可以对生物钟基因Per2启动子区组蛋白H4K16进行去乙酰化从而抑制其转录，且其作用强于对组蛋白H3K9的去乙酰化作用，进而调节生物钟与机体老龄化的平衡状态。由此可猜测，在异烟肼致人肝细胞损伤过程中，SIRT1作用于NF-kB p65的机制可能是其使NF-kB p65靶基因启动子区组蛋白发生去乙酰化，进而抑制基因转录，减轻肝损伤的发生，这还有待于进一步研究。

本研究结果表明，与空白对照组比较，异烟肼引起的肝细胞损伤中SIRT1表达减少，NF-kB p65的表达升高。SIRT1激动剂的加入可降低异烟肼诱导的NF-kB p65的表达，减少IL-6、TNF-α等炎症因子的产生；加入SIRT1抑制剂后，可使NF-kB p65表达进一步升高。以上结果表明，激活SIRT1对异烟肼诱导的肝细胞具有保护作用，它的机制可能是SIRT1通过作用于NF-kB p65，减少NF-kB与核内炎症基因结合，进而减少IL-6、TNF-a等炎症因子的产生。

综上所述，SIRT1在异烟肼药物的刺激下呈低表达状态，可能参与到异烟肼致人正常肝细胞损伤的过程中。尽管本研究推测出SIRT1低表达与异烟肼致人正常肝细胞损伤的关系，但是本研究只运用一种正常人肝细胞系HL-7702进行试验，未考虑到细胞系的多样性，也不能证实相关机制是否具有普遍性，仍需在其他人正常肝细胞系中进行验证和比较以及更深层次的体内外和临床实验研究来明确两者的相关机制，为今后的ADLI的预防性治疗提供更详尽的依据。