MMP-9过表达对骨肉瘤143B细胞侵袭与迁移能力的影响

齐巍，李勇，琚绍静，孙娜，张瑞杰

(1.河北省唐山市第二医院 创伤一科，河北 唐山 063000；2.河北省唐山市第二医院骨病科，河北 唐山 063000；3.华北理工大学基础医学院，河北 唐山 063000)

骨肉瘤是多发于青少年的恶性肿瘤，具有恶性程度高、转移早、转移率高、侵袭力强等特点，是导致治愈率低的主要原因。细胞外基质和基底膜是恶性肿瘤局部浸润和远处转移的重要天然组织学屏障[1]。肿瘤细胞可以产生多种蛋白水解酶，降解细胞外基质和基底膜，在癌细胞侵润和转移的过程中发挥作用，其中尤以基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase,MMP-9)发挥作用最为重要[2]。因此，探讨其与肿瘤侵袭、转移的机制及其关系具有重要的理论和临床意义。本研究以骨肉瘤143B细胞为研究对象，研究MMP-9过表达对成骨肉瘤143B细胞侵袭与迁移能力的影响，以及探讨MMP-9及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等与骨肉瘤的复发与转移的关系。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人成骨肉瘤143B细胞株由华北理工大学基础医学实验室馈赠，10% FBS、DMEM培养基和qRTPCR反应试剂盒均购置于美国Invitrogen公司,慢病毒过表达及阴性对照载体购置于上海吉凯基因化学技术有限公司，pLV-Puro MMP-9阳性序列:5'-UCCAGGGCGAGGACCAUAGAG-3'、pLV-Puro MMP-9阴性对照序列:5'-ACGUGACACGUUCGGA GAAGTCT-3'、Transwell小室购置于以色列BI公司，MMP-9和VEGF一抗和二抗均购置于北京中杉金桥生物技术有限公司，JSM-6030LV激光共聚焦显微镜购置日本电子株式会。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组转染 骨肉瘤143B细胞用含10%FBS、1%(100μmg/ml青霉素和10μmg/ml链霉素)的DMEM完全培养基，并置于37℃、5% 二氧化碳饱和湿度培养箱培养，当细胞生长汇合至80%时可进行消化传代。取对数生长期细胞，常规消化143B细胞，调整细胞浓度为2×105个/ml，接种于6孔板中，实验分为3组:转染组(转染pLV-Puro MMP-9过表达序列)、对照组(转染pLV-Puro MMP-9-NC序列)、空白组(PBS)。参照吉凯慢病毒转染说明书进行操作，48 h后激光共聚焦显微镜下观察转染率。

1.2.2 qRT-PCR检测mRNA表达 收集各组细胞，制成单细胞悬液，参照Trizol说明书一步法提取细胞MMP-9和VEGF的总RNA，检测RNA浓度复合实验要求后，取2 μl总RNA样品逆转录合成cDNA，再取1 μl cDNA为模板进行PCR扩增反应，MMP-9引物序列正向引物:5'-CTGTTGG ACTGCTGCTTTGCTG-3'；反向引物:5'-GTCTCCTGA AAGGTTTGGAAT-3'。β-actin引物序列正向引物:5'-GTTGGGACCTGAGAGACTA-3'；反向引物:5'-TGGCG ATGTCCAG TCACACT-3'。PCR扩增反应条件:95℃预变性20 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，40个循环后再72℃延伸10 min。采用比较2-△△Ct法对实验结果进行分析。

1.2.3 Western blot检测MMP-9和VEGF蛋白表达转染后48 h收集对数生长期各组细胞，提取各组细胞总蛋白，每组样品取35 μg蛋白质/泳道，进行SDSPAGE电泳，分别制配5%的浓缩胶和10%的分离胶，设置电压和电流进行电转，设置250 mA 90 min将凝胶中蛋白转移至PVDF膜；分别滴加150 μl一抗MMP-9和VEGF(1:2 000)以及一抗β-actin(1:1 000)，4℃过夜；TBST洗膜，每次10 min×3次；加相应100 μl二抗MMP-9和VEGF (1:1 000)，37℃培养1.5 h；TBST洗膜，每次10 min×3次。进行ECL显色，扫描仪扫描条带分析光密度值。

1.2.4 Tanswell侵袭实验检测细胞侵袭能力 以预冷空白培养基DMEM按1:8的比例稀释胶体，取100 μl稀释液滴加于Transwell小室的上室，置于37℃细胞培养培养基箱1 h即可制成Matrigel胶，常规消化单细胞悬液，调整细胞浓度为2×105个/ml；以100 μl/孔滴加至Transwell小室上层，滴加500 μl(20% FBS)的DMEM至下室，常规培养24 h。吸去小室内液体，使用湿润棉签轻拭擦去小室上层的Matrigel胶和未穿透过的细胞，将小室底部的聚碳酸酯膜用刀片切割下来，置于4%多聚甲醛液中，固定30 min以上；PBS冲洗3遍，对酯膜进行苏木素染色，封片。倒置显微镜下随机选取5个视野计数细胞并拍照，观察每个视野内穿过脂膜的细胞数量，以穿过脂膜的细胞总数为指标评价细胞的侵袭能力。

1.2.5 细胞划痕实验检测细胞迁移能力 采用记号笔在6孔板背面画出均匀间隔0.8 cm左右的横线，横穿过孔，每孔至少穿过5条线。各组细胞常规消化制成单细胞悬液，调整细胞浓度为5×106个/ml。细胞生长良好融合率达到80%时用10 μl的枪头作划痕，划痕完毕后，PBS轻轻冲洗3遍，漂洗去除划下的细胞，继续培养。按0和24 h时间点取样，拍照，并测量多个点划痕宽度，计算平均划痕愈合率。用Image J软件分析培养0和24 h时的各组划痕情况。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 20.0统计软件，计量资料以均数±标准差(±s)表示，比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验方法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 慢病毒介导细胞转染率

根据最强红色荧光判断转染率，激光共聚焦显微镜观察转染效率证实慢病毒介导的转染方法转染率高，可达90%以上。见图1。

图1 细胞转染率 (激光共聚焦显微镜×400)

2.2 MMP-9和VEGF的mRNA表达情况

实验组MMP-9和VEGF的mRNA相对表达量均高于对照组和空白组。经统计学分析，实验组MMP-9和VEGF的mRNA表达量相对于对照组和空白组均增高(P ＜0.05)，而空白组和对照组之间MMP-9和VEGF的mRNA表达量差异无统计学意义(t=20.625和16.472，P =0.165和0.072)。见表1和图2。

表1 各组MMP-9 mRNA和VEGF mRNA的表达量(n =6，±s)

表1 各组MMP-9 mRNA和VEGF mRNA的表达量(n =6，±s)

注:†与对照组、空白组比较，P ＜0.05

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图2 各组MMP-9 mRNA和VEGF mRNA的表达量

2.3 MMP-9和VEGF的蛋白表达情况

实验组MMP-9和VEGF的蛋白相对光密度值均高于空白组和对照组。经统计学分析，实验组MMP-9和VEGF的蛋白表达量均高于空白组和对照组(P ＜0.05)，而空白组和对照组MMP-9和VEGF的蛋白表达量差异无统计学意义(t=16.206和12.572，P =0.106和0.060)。见表2和图3。

表2 各组细胞MMP-9、VEGF蛋白的表达(n =6，±s)

表2 各组细胞MMP-9、VEGF蛋白的表达(n =6，±s)

注:†与空白组和对照组比较，P ＜0.05

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2.4 Transwell体外侵袭实验

图3 各组蛋白表达水平

图4 各组细胞的侵袭能力 (苏木素染色×200)

图5 各组细胞的迁移情况 (×40)

实验组穿过人工基底膜细胞数为(92.80±2.65)个/视野，对照组为(56.80±5.37)个/视野，空白组为(54.80±2.90)个/视野(见图4)。经统计学分析，个/视野，对照组为(56.80±5.37)个/视野，空白组为(54.80±2.90)个/视野(见图4)。经统计学分析，实验组穿膜细胞数高于对照组和空白组，差异有统计学意义(F=34.214，P =0.012)，而对照组与空白组比较差异无统计学意义(t=28.057，P =0.086)。说明实验组细胞的侵袭能力增高。

2.5 细胞的迁移运动能力

实验组、对照组和空白组划痕愈合率分别为(68.58±3.48)%、(32.17±3.25)%、(29.13±4.18)%(见图5)。经统计学分析，各组细胞划痕愈合率比较，空白组和对照组比较差异无统计学意义(F=9.207，P =0.155)，而实验组细胞划痕愈合率高于对照组和空白组(F=13.355，P =0.030)。表明实验组细胞的迁移速度快于对照组及空白组。

3 讨论

骨肉瘤为青少年最常见恶性肿瘤，恶性程度高，具有很高的致残率和致死率，侵袭性强，转移率高，预后较差[3]。调查资料显示，骨肉瘤易于肺部转移[4]。临床治疗骨肉瘤以手术截肢和辅助放化疗为主，患者的生存率无提高[5]。肿瘤转移早和术后易复发是影响骨肉瘤治疗和生存率的重要因素[6]。在监控骨肉瘤转移复发方面至今为止尚缺乏针对性的预测靶基因和肿瘤标志物，寻找针对骨肉瘤转移复发的肿瘤标志物对于骨肉瘤的早期诊断、早期治疗及预后检测具有重要的意义，因此，研究骨肉瘤侵袭、转移及复发相关的作用机制具有重要临床意义。本研究以骨肉瘤143B为研究对象，试图探索MMP-9过表达对成骨肉瘤143B细胞侵袭与迁移能力的影响。以及探讨MMP-9及VEGF与骨肉瘤的复发与转移的关系。

基质金属蛋白酶(MMPs)是锌离子依赖性蛋白水解酶，能降解细胞外基质的成分，与肿瘤浸润、转移、血管形成关系十分密切，细胞外基质间的黏附及细胞外基膜的降解被认为是恶性肿瘤侵袭转移的首要条件[7]。MMP-9是(MMPs)家族中重要的一员，属于Ⅳ型胶原酶，MMP-9蛋白酶是降解Ⅳ型胶原最重要的酶，与肿瘤的浸润、转移及血管形成能力有关[8-9]，并参与细胞外基质降解和再塑。MMP-9具有降解细胞外基质，破坏细胞的天然屏障的作用，同时具有调控细胞之间、细胞与基质间的黏附作用，促使癌细胞发生浸润和转移[10]；并且MMP-9还可以协同纤维蛋白溶解酶和组织蛋白酶等酶类，降解血管周围基质和血管基底膜[11]。这一过程强化癌细胞的局部侵袭和远处转移。李昕等[12]探讨MMP在骨肉瘤中的表达及与侵袭转移的关系，应用免疫组织化学法检测骨肉瘤MMP-9的表达，并分析其与无瘤生存率和侵袭转移的关系，发现MMP-9与骨肉瘤细胞的高侵袭转移能力相关。陈雷等[13]研究骨肉瘤组织中基MMP-9的表达情况，发现MMP-9可作为骨肿瘤恶性表型的标志，可作为骨肉瘤诊断的辅助指标，MMP-9是骨肉瘤细胞侵袭的标志。同样，LV等[14]在骨肉瘤患者发现，5年内发生肺转移患者中MMP-9阳性率明显高于5年内未发生肺转移患者，表明MMP-9高表达与骨肉瘤的侵袭转移能力密切相关，MMP-9有可能成为骨肉瘤肺转移的预测指标。本研究通过慢病毒介导MMP-9过表达转染人骨肉瘤143B细胞，Transwell体外侵袭实验结果显示，实验组细胞的侵袭能力高于对照组和空白组，MMP-9过表达可促进增加骨肉瘤细胞的侵袭能力。细胞划痕实验结果显示，实验组细胞划痕愈合率高于对照组和空白组，实验组细胞的迁移速度快于对照组及空白组。说明MMP-9过表达促进骨肉瘤143B细胞的侵袭和迁移能力。

VEGF是目前作用最强的一种促进肿瘤血管生长因子，通过与内皮细胞特异性受体结合促进内皮细胞增殖，增加微血管通透性，促进血管形成。同时它可以旁分泌的方式作用于内皮细胞，刺激内皮细胞分泌MMP-9。VEGF与肿瘤生长、浸润及转移密切相关。研究发现MMP-9在降解细胞外基质的过程中，能够释放出生长因子如b-FGF、TGF-β等，它们能够上调VEGF的表达[15]。黄自锋等[16]研究MMP-9、VEGF的表达与骨肉瘤血管新生及临床复发转移的关系，结果发现MMP-9、VEGF共同参与骨肉瘤的血管生成并协同表达。李昱等[17]发现分化程度较低、浸润程度较深、伴淋巴结转移、临床分期较高的非小细胞肺癌患者，同时伴有MMP-9与VEGF的高表达，提示MMP-9与VEGF有着内在联系，MMP-9作用于VEGF因子。本研究以慢病毒介导MMP-9过表达转染人骨肉瘤143B细胞，qRT-PCR结果发现，实验组MMP-9和VEGF mRNA的表达量增高，免疫细胞化学染色结果发现，实验组MMP-9和VEGF蛋白表达量增高，并促进骨肉瘤143B细胞侵袭和转移。同样，有研究发现VEGF可通过ETS-1调节MMP-9启动子从而上调MMP-9 mRNA的表达[18]。POYER等[19]发现MMP-9与VEGF之间相互调节促进对方的分泌，两者之间存在着正反馈调节作用。

在肿瘤细胞从增殖到局部浸润和远处转移这一过程，蛋白水解酶介导的细胞外基质降解、基底膜降解和肿瘤微血管的形成起到关键作用。MMP-9和VEGF在骨肉瘤的的浸润和转移过程中起着重要作用，骨肉瘤中MMP-9和VEGF可作为评价骨肉瘤预后指标，目前从临床研究已初步揭示了MMP-9和VEGF表达水平与骨肉瘤患者预后之间的关系。同时，通过对其调控机制的进一步深入研究，将有助于找到治疗骨肉瘤转移的有效生物靶点，给广大骨肉瘤患者带来福音。