类风湿关节炎不同中医证型外周血Th17/Treg细胞表达特点研究*

王晓慧 潘文萍 孙素平 王冉悦 张 胜

1 山东中医药大学 山东 济南 250011 2 山东省千佛山医院 山东 济南 250014 3 山东中医药大学附属医院 山东 济南 250011

类风湿关节炎（RA）是以侵袭性滑膜炎为特点的一种自身免疫病。Th17细胞是近几年被发现的一种新型T细胞亚群，Th17/Treg细胞的失衡对于RA的发病至关重要。本文从Th17/Treg细胞等细胞免疫学角度入手，旨在为类风湿关节炎中医辨证分型提供更多参考依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料：RA病人来自于2016年12月～2017年12月在山东中医药大学附属医院风湿病科住院患者，共117例，男：女比例为1：4.57。湿热痹阻证54例，占46.15%；寒湿痹阻证14例，占11.97%；痰瘀痹阻证26例，占22.22%，肝肾亏虚证23例，占19.66%。RA患者最小29岁，最大75岁；平均年龄57.61±11.38岁，平均病程9.52±7.96年，四种证型在性别和年龄差异上无统计学意义（P＞0.05）。健康对照组来于本院查体中心性别和年龄匹配的健康人群，年龄在18～55岁，平均年龄47.90±9.74岁。

1.2 诊断标准：西医诊断标准参照2009年ACR/EULAR对RA的分类标准[1]，中医诊断标准参照《中药新药临床研究指导原则》[2]辨证分为湿热痹阻证、寒湿痹阻证、痰瘀痹阻证、肝肾亏虚证四种证型。由2名中级职称以上的医师指导辨证分型。

1.3 检测指标：①Th17细胞：抽取纳入人员晨起空腹血3～4ml于肝素管内，取新鲜抗凝全血200μl于EP管中，加入RPMI-1640培养基等体积混匀，依次加入新鲜配置的刺激液（PMA工作液50μl，离子霉素工作液20μl，莫能霉素工作液20μl），混匀，打孔，放入37℃，5%CO2孵箱中孵育4小时。孵育完成后取出混匀，取样本150μl加入流式细胞管内，加入PE-Cy5-CD4单克隆抗体，室温避光进行细胞表面染色15min。加入细胞破膜固定剂避光孵育15min，用PBS溶液洗涤2遍，加入FITC-IFN-γ抗体、PE-IL-17抗体、APC-IL-22抗体避光进行细胞内染色，孵育完成洗涤后制成细胞悬液，进行流式细胞学上机检测。②Treg细胞：取新鲜抗凝全血200μl于流式管中，加入FITC-CD4、PE-Cy5-CD25抗体进行表面染色，孵育20min后加入破膜固定剂，避光孵育60min，再加入破膜缓冲液，加入APC-Foxp3抗体4°（或室温）避光孵育30min，孵育完成洗涤后制成细胞悬液，进行流式细胞学上机检测。③临床及实验室指标：临床指标包括DAS-28（28个关节的疾病活动分数）评分，疼痛VAS评分（0～100分），关节肿胀数，关节压痛数；实验室指标包括血沉（ESR），C反应蛋白（CRP），类风湿因子（RF），抗环瓜氨酸多肽（CCP）抗体。

1.4 统计学方法：采用SPSS20.0统计软件分析，计量资料以±s表示，计数资料采用卡方检验；样本资料符合正态分布用t检验，不符合正态分布用秩和检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组Th17/Treg细胞表达情况比较：见表1。

表1 两组Th17/Treg细胞表达情况比较（±s）

表1 两组Th17/Treg细胞表达情况比较（±s）

注：与健康对照组比较，*P＜0.05。

组别RA病人组健康对照组Th17细胞（%）2.30±0.75*1.16±0.16例数117 20 Treg细胞（%）2.32±0.94*4.01±0.99

2.2 不同证型RA病人Th17/Treg细胞表达情况：见表2。

表2 不同证型RA病人Th17/Treg细胞表达情况（±s）

表2 不同证型RA病人Th17/Treg细胞表达情况（±s）

注：与健康对照组比较，*P＜0.05。

证型湿热痹阻证寒湿痹阻证痰瘀痹阻证肝肾亏虚证健康对照组Th17细胞（%）2.88±0.66*1.61±0.32*1.92±0.40*1.77±0.23*1.16±0.16 Treg细胞（%）1.82±0.83*3.25±1.01*2.14±0.39*3.15±0.56*4.01±0.99

2.3 不同证型RA病人DAS28评分构成比情况比较：见表3。

2.4 不同证型RA病人临床及实验室指标分布情况比较：见表4。

表3 不同证型RA病人DAS28评分构成比情况比较[例（%）]

表4 不同证型RA病人临床及实验室指标分布情况比较（±s）

表4 不同证型RA病人临床及实验室指标分布情况比较（±s）

注：与肝肾亏虚证比较，*P＜0.05。

证型湿热痹阻证寒湿痹阻证痰瘀痹阻证肝肾亏虚证抗CCP抗体455.19±556.03 462.60±360.24 477.20±543.89 443.58±568.42 VAS（100mm）65.28±10.88*61.79±9.12*64.81±7.94*53.26±6.14关节肿胀数（个）7.09±2.54*3.79±1.58*4.00±2.10*2.35±1.20关节压痛数（个）12.26±3.09*9.36±2.37*10.38±2.43*6.83±1.90 ESR（mm/h）62.24±24.86*47.50±27.32*52.15±25.75*25.70±17.39 CRP（mg/L）46.49±34.38*29.76±31.30 27.32±23.86*11.87±13.01 RF（RU/ml）481.95±879.61 229.01±370.63 470.23±639.72 309.39±349.20

3 讨论

RA属于中医学“痹证”范畴。痹证症状纷繁复杂，有时其外在表现不明显，这给我们的临床辨证分型造成了一定的困扰。这就需要一些实验室指标来辅助中医辨证分型，同时也是为中医提供一些客观化依据，让我们更好地选方用药。Th17细胞是2005年由Park等[3]提出的一种新的T细胞亚群，主要分泌白介素-17而不分泌γ-干扰素，可以激活补体，活化中性粒细胞释放炎症性因子，介导组织的炎症反应。TH17细胞参与了RA免疫炎症反应、滑膜增殖、骨侵蚀多个病理环节。本研究中RA患者Th17细胞表达在（2.30±0.75）%，明显高于健康对照组（1.16±0.16）%。调节性T细胞（Treg）是由Gershon[4]提出的一类具有免疫调节作用的细胞亚群，可以降低炎性细胞因子产生，减少抗体分泌，维持自身免疫耐受。在本研究中，RA患者外周血中Th17细胞明显升高，Treg细胞明显下降，并且这两者都与疾病严重程度相关，而且不同证型中两者的表达也有显著差异性。

在本研究中我们发现，湿热痹阻证和痰瘀痹证中DAS28评分约有80%以上，而寒湿痹阻证和肝肾亏虚证所占比例较低，而肝肾亏虚证，主要是处于中疾病活动度。ESR、CRP等实验室炎症指标很高，相应的两者Th17表达也较健康对照组异常升高，而Treg细胞却显著性降低。两种证型患者体内Th17/Treg严重失衡。相关性检验分析提示，证候分型与疾病活动度呈现良好相关性，而与病程不相关。说明在疾病后期，患者虽有正虚之候，但当处于疾病炎症活跃期时，仍以湿热和痰瘀为主要证候。在本研究中，活动期的RA一部分以湿热为著，另一部分以痰瘀为著，同时Th17细胞也是高表达，提示我们应该以清热解毒化痰祛瘀为主，选用金银花、虎杖等一些清热解毒药物抑制炎性渗出，同时兼顾瘀阻经络，选用赤芍、牡丹皮等一些活血化瘀药抑制血管翳生成，从而抑制体内细胞因子的致炎作用，增强抗炎作用。此外，病程日久耗伤肝肾，机体炎症活动下降，应以健脾补肾祛寒为主，培补正气。

由于痹证是一种慢性进行性疾病，炎症因子在体内反复波动，耗伤人体正气，而病久累及肝肾，又反噬筋骨关节，形成恶性循环，故在治疗过程中要辨证审因，注意疾病的客观化指标，综合运用辨病辨证施治。