猪圆环病毒2型快速直接PCR检测方法的建立与流行病学调查

徐引弟 ，闫静娟 ，焦文强 ，王治方 ，张青娴 ，朱文豪 ，李海利 ，王克领

（1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所，河南 郑州 450002；2.河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室，河南 郑州 450002）

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属，是无囊膜包裹的单股负链环状DNA病毒。PCV根据血清型可以分为PCV1，PCV2和PCV3。其中，PCV1在猪群中广泛存在，但无致病性[1-3]。PCV2主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Post weaning multi systemic wasting syndrome，PMWS），该病多发生于5～12周龄的保育猪，临床主要表现为精神沉郁、被毛粗乱、呼吸困难、腹泻以及进行性消瘦。此外，PCV2还易和呼吸与繁殖障碍综合征病毒（PRRS）、细小病毒（PPV）、伪狂犬病毒（PRV）等发生混合感染，造成并发或继发感染[4-7]。自1991年PMWS首次报道以来，欧洲、亚洲以及大洋洲等先后报道此病，呈全球性分布[8-10]。2001年，郎洪武等[11]首次成功分类PCV2，证明我国存在PCV2感染情况。华中农业大学何启盖教授课题组是我国第一个报道我国存在致病性的新型猪圆环病毒PCV3，研究发现，PCV3与猪只繁殖障碍等疾病相关联，之后山东农业科学院畜牧兽医研究所郑书轩等也报道了PCV3的存在[12-13]。

PCV2基因组为小型的单链环状DNA，大小约为1.7 kb，可能包含11个开放阅读框（open reading frames），其中有3个主要开放阅读框。ORF1为最大开放阅读框，与病毒滚环复制有关。ORF2编码Cap结构蛋白，构成病毒核衣壳，具有较大变异性。ORF3可能与诱导病毒凋亡以及编码病毒致病性相关蛋白有关[7]。

对于PCV2的诊断方法有很多，比如病毒分离法、酶联免疫吸附试验法、免疫荧光法、荧光定量等[13-14]，但是与这些方法相比，本试验建立的直接PCR检测方法操作简单方便，快速、特异，敏感，更适合对于PCV2引起疾病的及时、准确诊治和防控，有利于流行病学调查。

本试验建立的直接PCV2的PCR检测方法用于河南省PCV2的检测，研究PCV2的流行情况，并对阳性样品进行了ORF2基因序列分析，旨在为PCV2的防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 病料采集

样品来自2016年5月至2017年5月河南及周边地区疑似PCV2感染送检的猪组织病料，包括脾脏、肺脏、肾脏、淋巴结等组织。病猪肺脏颜色为灰色、质地似橡皮，肾脏有不同程度的出血点，淋巴结肿大等特征。分别取病变明显和正常组织交界部分的病料用于试验研究。

1.2 试剂

2×Direct PCR Mix，Hot Start Taq 酶，Ezup 柱式动物基因组DNA抽提试剂盒，购自生工生物工程（上海）有限公司；DL2000 DNA Marker，琼脂糖均购自宝生物（大连）生物有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.3 引物设计

参考GenBank中收录的PCV2 ORF2的核苷酸序列，应用OLigo6.0软件设计1对引物，P1，P2用于样品的检测，目的片段长494 bp。P1:5′-CCGCA CCTTCGGATATACTATC-3′，P2：5′-CACGGATATT GTATTCCTGGT-3′，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，于-20℃保存。

1.4 样品处理

采集有PCV2型典型症状的猪只的肺脏、肾脏、脾脏、淋巴结等病变组织的病料少许研磨，加入2 mL的灭菌PBS缓冲液，低速离心数秒后取上清液直接用于PCR模板。

1.5 直接PCR检测方法的建立

1.5.1 直接PCR反应 反应体系为20 μL，含有处理后的样品上清 1 μL，2×Direct PCR Mix 10 μL，10 pmol/L P1 1 μL，10 pmol/L P2 1 μL，5 U/μL Hot Strart Taq 酶 0.5 μL，加灭菌 ddH2O至 20 μL。充分混匀，阳性对照和阴性对照分别取1 μL加入19 μL PCR扩增试剂。PCR扩增程序为：98℃30 s；然后35个循环：98℃5 s，55℃5 s，72℃5 s；最后 72℃1 min。取5 μL扩增产物电泳观察结果。

1.5.2 直接PCR特异性试验 将已经鉴定的猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）阳性病料为模板，用1.3所设计的PCV2的特异性引物P1，P2按照已经建立的方法进行扩增，电泳，并观察结果。

1.5.3 直接PCR敏感性试验 采集的样品处理后取1 μL上清作为模板，依次10倍稀释至10-5，各取1 μL作为直接PCR扩增，确定其敏感性。

1.6 临床样品的调查

对2016年5月至2017年5月送检的河南及周边地区疑似PCV2感染的125份样品的组织病料采用建立的直接PCR检测方法进行检测，阳性结果进行测序分析。

2 结果与分析

2.1 直接PCR方法的建立

样品经过简单处理，加入直接PCR体系扩增，结果显示，该PCR体系可以扩增出一条约为494 bp的PCV2的基因片段（图1），且符合预期片段大小。

2.2 特异性试验

在反应程序、其他反应体系不变，只有模板不同的情况下用建立的PCR方法对PCV2扩增出了494 bp的目的基因片段，而PEDV，PRRSV，CSFV和PRV均未扩增出特异性条带（图2）。证明该方法有较好的特异性。

2.3 敏感性试验

将模板按10倍浓度梯度稀释分别扩增，结果显示，模板稀释度为100（原液），10-1，10-2，10-3时，均能扩增出特异性条带，对10-4，10-5均无扩增（图3），说明该体系对PCV2的扩增下限浓度为10-3，证明该方法敏感性好。

2.4 临床样品的调查

应用建立的PCV2 PCR检测方法检测2016年5月至2017年5月送检的河南省疑似PCV2感染的125份样品。结果显示，阳性样品有55份（图4），阳性率高达44%。序列分析结果显示，这55株阳性PCV2毒株之间的ORF2区域核苷酸同源性为88.7%～99.8%，42份在PCV2b基因群。结果表明，河南省PCV2感染率较高，PCV2b为流行血清亚型，病毒变异严重。

3 讨论

PCR方法敏感性和特异性较好，是临床病原学诊断中较为普遍的一种方法。但是传统的PCR方法从样品的裂解、DNA提取、PCR扩增到电泳检测需要5 h以上。本试验建立的PCV2快速直接PCR方法，样品简单处理，直接扩增，快速反应，整个过程1 h内完成。敏感性试验结果显示，建立PCR检测方法的灵敏度可达病料模板10-3稀释度。特异性试验结果显示，本试验建立的PCV2 PCR检测方法能扩增出494 bp目的片段，对PEDV，PRRSV，CSFV和PRV均未扩增出目的片段，说明该方法有很好的特异性。因此，建立的直接PCR检测方法为PCV2的检测及流行病学调查提供了简单、有效的方法。

通过建立的PCR检测方法，对2016年5月—2017年5月共收集到的125份疑似PCV2感染样品进行检测，共检测到55份阳性样品，阳性率高达44%，这表明在河南省PCV2感染率较高。

对PCV2阳性病料ORF2基因进行序列分析，同源性在88.7%～99.8%，主要在PCV2b基因群。PCV2b为流行血清亚型，与前人研究结果一致[15-20]，为PCV2的防控和新型疫苗研制奠定基础。