细胞重组的转化应用

◎ 斯坦福大学干细胞生物学和再生医学研究所病理学副教授 马里厄斯.韦尼格

在很久之前,我们知道细胞发展被称为是单向的，像胚胎大部分的发展要成熟，由胚胎细胞分化为不同类型的细胞，最后在我们成人体内可以看到细胞不断成熟。但是都认为细胞分化是单向的，但是由于不同的编码编程以及不同的组合的经验，可以把一个完全成熟的细胞进行转化，回到它的原始状态，这就是我们首先要分享的内容，我们所说的细胞和它的研究。

之前也有克隆的研究，东京大学的教授认为一些转录的因素可以帮助我们把细胞转化为和胚胎干细胞非常类似的细胞。因此我们就在想，这种直线性的发展，我们要考虑到这些细胞之间的关系，或者说我们把一个非常成熟的状态的细胞，假如说成人细胞如何把它回归到原始的胚胎细胞的状态，这是非常精彩的现象。如何把一个成熟的成人细胞转化成为原始的状态，如何把纤维元细胞变为神经元细胞？我们认为，诱导神经元细胞是从纤维元细胞中获得的，直接变为神经元细胞。

设想如何从病人身上找到一些样本？我们把这些细胞进行重组，从IPS可以把它们直接进行组合，利用这些细胞实现葡萄糖的运输。帕金森症的一些患者主动加入了我们的研究，我们希望能够了解人类的基因工作机理以及基因如何突变的，如何会导致这些老年痴呆症以及帕金森症。

我们思考这个问题从何而来？这是一个非常积极的项目。我们希望能够进一步的思考，找到这种结果。如何能够实现这种转换，从一个不同的细胞类型、纤维元细胞转化为神经元细胞，他们本来没有什么关系，这个转录的因素叫做Ascl1，这是一个非常基本的转换，从Helix可以找到它的转录因素。这些因素一般来说是可以把不同的链整合在一起。我们要问的第一个问题是：Ascl1在纤维元细胞组中处在哪个位置，纤维元细胞一旦呈现出来的时候，我们希望找到它的基因组，它的基因阻在哪个部分，基因组中SCRE在哪个地方呢？我们可以看到这个基因组在这里有一个热图，我们利用IP序列的方式找到他的热图，在MEFs以及BAM方面它的特征跟NPCs是一样的，也就是说这些基因的目标是非常开放的，是在纤维元细胞当中可以找到的，或者说我们可以找到Ascl1，纤维元细胞里面可以找到相似的细胞组行，这是它的转录里面非常相似的类型，就是它的这种染色质是如何整合在一起的。为了把他们区分他们是开放的，让你可以找到这些基因序列。到底我们怎么样能够在这个过程中进行分别，尤其是在表达之前可以进行区分。首先是经过处理，还有再目标的基因分子。看这周围两者相聚比较近，这是科学上的表述。也就是说他们的DNA在核附近，做这个附近意味着他们没有办法转录，是封闭的，这是非常重要的一点。只有一部分的转录因子是存在，也知道他们可以实现转录，他们被称之为先锋因子。所以我们知道Ascl1指的是有相应的靶向先锋因子的。

在目标方面，可以看出有一些差异的存在，一旦表达了出来，就可以开放性的表达，这个区域对其他转录的区域是开放，对于其他染色质的建模都成为了可能性，我们希望通过这种方式更好地了解，并且衡量实际所发生的状况。为了能够做到这一点，把我们的方法进行了一定的优化。我们的方法叫做ATAC-seq，把这个染色质开放又关闭，这个开放可以了解整个发展进程的变化。或者是从DNA的阶段出现。这里蓝色所展示就是我们这个TM-5，其实是我们秩序的指引物，而我们的Chromatin一旦进入核的区域就没有办法进行融合了。我们把这个方法应用到一系列的重要的结合点，这个结合点也显示出染色质动态的变化。在图中黑色的曲线所代表的区域，如果出现了lttTA是有基本的信号，但是如果说我们在经过了12个小时之后，我们的这个信号就会极大的提升，而且是非常明显的，而且是开放式的，大家可以在图中看到这个信号不断增加，在整个转录过程中这个信号是在快速增加的。红色是不同的效率，离染色质比较近。在这一块经过五天之后，明显可以发现这个数值的变化还是比较大的。也就是说，在两边有两个核的区域。这个核的区域正好就在中心的两边。因此，一个单一转录的区域是如此的漂亮，他们有着直接的靶向区域，从一开始的时候是更加随机的分配的模型，接着逐渐转化到了更加高结构化的架构，在这里给大家展示的数据也有类似的观点。

基于颜色密度不同，可以看到这个颜色之间出现的分辨率的情况，在这里我不想浪费大家的时间没有办法讲特别细，但是我想让大家可以看一下，这两张图其实是有所不同的。因为在这里有两朵云，第二朵云这两边就更平一些，这就是我们所谓的第二个细胞核的层，而且跟第一层会有着一定的重叠。

刚才给大家展示了都是一些其他的数据，这都是从靶向、目标的角度来思考的。基因学当中可以分析，如果改变基因其他方面会带来怎样的影响？对于所有基因科学家来说，因为我们的基因协会是面向开放的，我们就能够看到有很多的变化已经出现了。最上面的区域密度是比较大，还有一些平均密度比较高的区域正在关闭，而其他的区域却并非如此。这其实是因为我们激活了它的转录因子，我们到底应该怎么样决定什么时候应该关闭，最重要的是我们可以看一下目前没有非常明确的机制，我们必须依靠内部的方法和工具，包括一些通用的效果和方法来实现这一点。

我们发现的另外一个惊奇是，做调查的时候可以看到对不同的情况，从0到220，在这个过程中可以看到随着地点的放开，这些变化不是渐进式的，这里实现的是两天到五天时间非常性的提升。我们的整个转录过程其实也是逐渐所产生的。而且，是需要我们进行缓慢的安排。在此过程中出现了非常快速、明显的转化，就像我们在建模一样的。这些调整是对序列的调整。

第二天和第五天的时候，是在逐渐的成熟化的转换过程中。比如说在第二天的时间轴，在我们通过控制、对照的过程来进行一些区分，到第五天产生了更加巨大的变化。从细胞生物学的角度来看，大部分的变化都是后期产生的，都是需要有相应的设计，我们在一开始的时候不需要期待有太多的变化，但是实际上在最后我们的变化是逐渐累计而成的。很遗憾没有特别多的时间给大家介绍另外一个转录的流程，这个转录的流程就只能给大家稍微做一些简要介绍了。

我想跟大家介绍一下我们当前所做的工作和研究。这个研究我们把它叫做Myt1l。通过我们神经元的流程有一个过程，这个过程是对非神经元程序的抑制，我们发现它们通过配合能够形成更好的效果，它们可以更加有效地开发并且关闭神经元的程序，也有相应神经元负责不同的基因。比如说对部分神经元的编辑。跟大家强调一下，我们当前所看到的一些主要结论：

IPS细胞是如何运作的？大家比较熟悉，有各种不同的类型。为了强调它们之间的差别，我想跟大家谈一下最近所发布的一些资料当中设计出来的信息，可以看到这两者之间的机理是有多大的差异。这里主要是有四类不同的程序，从左往右，首先是MES，第二个是经过48小时，第三是经过预先的处理的方式，最后是ESC的方式。给大家展示的是，如果EVs增加，那么这个增加就要求我们进行一些更加详细的分析，有没有出现一些特定的表达，如果说它确实快速地关闭了我们所需要的类型，而且这个程序本身是需要能够得到表达的。

接下来考虑整个刺激的变化，确实会有一些变化的发生，有一些是技术上很好的，可以测量和评估的，包括对于阻蛋白调节的变化，这些变化需要很长的时间累计，才能产生明显的效果。

转录因子去哪里了？我们有一些提升的因素，这些因素当然受了一些主要的推动因素的影响，比如说βB，这一块我们可以看到这个转录因子失去了它兼容性，没有办法更加明显地表现出来。如果说我们现在去问到底影响整个的编码因素是什么？我们通过观察发现，这些再次编辑作用不是在初期所出现的，而是有不同的变化呈现，是有结合的，最后得出来的结论是即使说它可以引起转录因子的变化，正是这样的因素关闭了刺激的因素。这就花了非常长的时间，专门用相当的精力进一步探索到底是由哪些因素起到的作用。我们的这种转录因素可以找到合适的目标，而且在这样的纤维元细胞里面可以明确想要找到具体的基因序列是哪个。

我想进一步地阐述这种机理的原理。我们可以看到这种基因的序列的研究。可以带来非常有趣的观察，调整出其中一个比较有趣的结论跟大家分享一下。

这里有100-120个左右的细胞，从纤维元细胞到神经元细胞，基于它的基因表达相似之处，发现这个基因里面有这个曲线，这就是一个重组的路径，另外两个比较有趣的现象发生在这个重组路径中，这些细胞他们之前所说诱导神经元细胞到神经元细胞的过程，跟原始路径是截然不一样的，而且也是呈现出一种向下的曲线。这个五个细胞不能从下降的曲线、下降的转录因素里面找到。这里我们所说的Ascl1，这几个细胞形成一个大的群体，很多细胞通过诱导产生，可以用于我们的分析。因此，Ascl1这些细胞他们可以产生出非常密集的趋势，这些细胞可以非常有选择性的进行表达，而且它们呈现出比较统一的表达类型。为了增强这一点我们也是在这个区域来分析纤维元细胞和神经元的对比。可以发现这些细胞是在原始项目里面诱导出来，某种情况下它们的细胞越来越多，Ascl1是一个比较启动的因子，可以让我们了解这样一个基因序列的作用，可以作为一种转录的启动因素，因此我们就会思考Ascl1是否有一些深入化学的特性和肌肉有关、和神经元有关，在我们的研究过程中在我们的项目里面其实没有发现这些具体的信息，对于这样一个体我们需要进行不同研究。思考一下MyoD和Ascl1的特点，在神经细胞里面把MyoD放到其中，他们有相似的地方。Ascl1可以诱导神经元细胞，MyoD1可以诱导肌肉细胞，这张图中可以显示出结果。另外，在这个项目里面还可以发现这些Ascl1有关的序列是被激活的，我们把这样的两个转录因素进行具体的描述，在纤维元细胞中如何进行争取的。我们来研究Ascl1和MyoD这些转录因素的相似之处。在这些项目中它们有相同的整合方式，尽管说这种整合方式比较相似，这个转录根本上来说是截然不一样的。因为它的功能性是相反的，从神经元到纤维元细胞到肌肉细胞有不同的过程。

它们这种转录功能是不一样的通过一定的数据分析之后，我们需要看一下它的这种整合类型的数量，从数量方面进行考量。通常我们把这些数据进行分层、进行分类，并分析它们结合的强度。Ascl1有很强的整合效果，而从数量角度来看MyoD的整合方式是比较强的。另外，还有一种方式来评估它的基因序列，可以看出Ascl1以及MyoD基因表达的相关性。这可以帮助我们解开问题的答案。像我们之前所说的，Ascl1是和神经元细胞以及肌肉细胞有关，从MyoD的角度进行考量。我们可以看一下它的这种肌肉细胞和神经元细胞的关系，它的表达性可能说不像MyoD表达性那么强，那么因此如何实现一种平衡，能够把MyoD和Ascl1之间的基因表达进行平衡，能够把这些神经元进行启动。有一种抑制剂，可以抑制这种肌肉细胞，如果把MyoD和Ascl1进行抑制的话形成这样一个结果，MyoD有一个非常强的肌肉细胞表达。