miRNA-15a通过靶向Wnt3a调控Wnt/β-catenin信号通路抑制卵巢癌的发展和转移

王雨艳 黄鑫 王琰琰 张欣

卵巢癌是高致死率的妇科恶性肿瘤，患者5年生存率不足30%［1］。因早期无明显症状，大多数患者在就诊时已处于晚期。微小RNA（microRNA，miRNA）通过抑制靶基因的翻译或促进其mRNA的降解，调控靶基因的表达，影响肿瘤的发生、发展进程。研究证实，miRNA-15a在多种肿瘤进展中发挥类似“抑癌基因”的作用［2］。有研究发现，卵巢癌细胞中miRNA-15a低表达［3］，但在卵巢癌中miRNA-15a是否发挥“抑癌基因”功能目前尚未明确。因此，本研究旨在研究miRNA-15a在卵巢癌发展转移中的作用，并探讨其相关机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本 收集锦州医科大学附属第一医院2012年5月至2015年6月经手术切除的卵巢癌及对应癌旁组织（距肿瘤边缘＞4 cm）标本各32例，术前未行化疗。本研究经本院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。

1.1.2 试剂 DMEM培养基购自美国Gibco公司。Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。miRNA-15a模拟物、无义miRNA及其引物均购自广州锐博生物公司。miRNeasy Mini Kit试剂盒购自德国Qiagen公司。Wnt3a、β-catenin、Cyclin D1、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、E-钙离子依赖的细胞黏附素（E-calcium-dependent adhesion，E-cad）抗体均购自美国Abcam公司。GAPDH抗体及二抗购自美国PTG公司。Transwell小室购于美国Millipore公司。Matrigel基质胶购于美国BD公司。Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自北京四正柏公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将卵巢癌细胞SKOV-3在37℃、5%CO2含10%FBS、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中培养。SKOV-3细胞分为采用Lipofectamine 2000转染miRNA-15a模拟物（5×10-8mol/L）的实验组和转染无义miRNA（5×10-8mol/L）的对照组。

1.2.2 RT-PCR检测 细胞转染48 h后，收集细胞提取RNA，根据miScriptⅡRT Kit试剂盒说明书步骤，反转录为cDNA。取1 μL cDNA进行RT-PCR扩增反应。反应条件为94℃ 5 min，95℃ 5 s，65℃ 35 s，共35个循环。以U6为内参，采用2-ΔΔCt方法计算miRNA-15a相对表达量，其中 ΔΔCt=ΔCt（样本）-ΔCt（内参）。实验重复3次，计算平均值。

1.2.3 CCK8实验 细胞转染24 h制备细胞悬液，调节细胞密度为1×104个/mL，取0.1 mL/孔细胞悬液接种于96孔板。每隔24 h加CCK8试剂，培养1 h后测450 nm处的吸光度（optical density，OD）值，实验重复3次，绘制细胞增殖曲线。

1.2.4 Transwell实验 细胞转染24 h后，采用无血清培养液培养细胞12 h，制备无FBS细胞悬液，调节细胞密度为1×104个/mL，Transwell小室铺胶，上室加入0.2 mL细胞悬液培养细胞24 h，下室加含10%FBS培养液，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染液染色，切下小室基底膜，拍照计数。实验重复3次。

1.2.5 流式细胞术检测 细胞转染24 h后，采用无血清培养液培养细胞24 h。收集细胞并加入缓冲液重悬细胞，调节细胞密度为1～5×106个/mL，取0.1 mL细胞悬液于流式管中，按试剂盒步骤进行Annexin VFITC/PI双染后上机检测。采用Flow Jo软件对结果进行分析。实验重复3次。

1.2.6 Western blot法检测 细胞转染48 h后提取蛋白，SDS-PAGE电泳后电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，在一抗中4℃孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的二抗孵育1 h，ECL显色。采用Image J分析图像，相对表达量=目的蛋白/GAPDH灰度比值。实验重复3次。

1.2.7 双荧光素酶报告实验 将Wnt3a基因的3'UTR序列及突变后的3'UTR序列克隆到p-GL3.0质粒构建双荧光素酶报告载体，即野生型Wnt3a-3'UTR（wt）、突变型Wnt3a-3'UTR（mu）。将该载体与miRNA-15a模拟物共转染细胞，常规培养48 h后使用Dual-Glo Luciferase Assay System检测荧光值。实验重复3次。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 卵巢癌组织中miRNA-15a表达及miRNA-15a模拟物对细胞增殖的影响

与癌旁组织中miRNA-15a相对表达量0.692±0.228相比，卵巢癌组织中为0.911±0.209，显著下降（t=2.908，P＜0.05，图1A）。与对照组相比，转染miRNA-15a模拟物后，卵巢癌细胞SKOV-3中miRNA-15a的表达水平显著上调（P＜0.01，图1B），miRNA-15a过表达细胞构建成功。在SKOV-3细胞转染miRNA-15a模拟物48 h后，与对照组相比，miRNA-15a过表达显著抑制实验组细胞增殖能力，差异具有统计学意义（P＜0.05）。继续培养72 h后，miRNA-15a模拟物对SKOV-3增殖能力的抑制作用依然显著（P＜0.05，图1C）。

2.2 miRNA-15a模拟物对卵巢癌SKOV-3细胞侵袭及凋亡的影响

Transwell侵袭实验结果显示，与对照组189.667±14.742相比，miRNA-15a过表达显著抑制实验组的细胞侵袭能力96.667±13.614，差异具有统计学意义（t=8.027，P＜0.05，图2A），表明miRNA-15a过表达能够抑制卵巢癌细胞侵袭。流式细胞术结果显示，miRNA-15a过表达实验组的27.400%±0.854%显著高于对照组细胞凋亡率6.933%±0.379%，差异具有统计学意义（t=37.942，P＜0.05，图2B）。

2.3 miRNA-15a模拟物对SKOV-3细胞中的Wnt/β-catenin信号通路及Wnt3a的影响

Western blot法检测结果表明，实验组SKOV-3细胞中Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白Wnt3a及其下游蛋白β-catenin的表达量均显著低于对照组（P＜0.05），该信号通路的下游蛋白Cyclin D1及VEGF表达水平也均相应降低（P＜0.05），E-cad表达水平相应增高（P＜0.05），见图3。

与对照组中的Wnt3a蛋白相对表达量1.017±0.126相比，实验组为0.643±0.110，显著降低（t=3.873，P＜0.05，图4A）。荧光素酶报告基因实验显示，在SKOV-3细胞中miRNA-15a模拟物显著抑制Wnt3a-3'UTR报告载体的荧光素酶活性（P＜0.05，图4B），Wnt3a与miRNA-15a结合位点UGCUGCUA突变为ACGACGAU后，miRNA-15a模拟物则无法抑制Wnt3a-3'UTR报告载体的荧光素酶活性（P＞0.05）。证实miRNA-15a能够直接靶向卵巢癌细胞中Wnt3a-3'UTR，抑制其表达。

图1 卵巢癌组织及细胞中的miRNA-15a表达

图2 miRNA-15a模拟物对SKOV-3细胞侵袭及凋亡的影响（0.1%结晶紫染色×40）

2.4 Wnt3a对SKOV-3细胞增殖、侵袭及Wnt/β-catenin信号通路的影响

为进一步证实miRNA-15a对卵巢癌生长转移机制的影响，构建pcDNA3.1-Wnt3a表达载体（pcDNA3.1空白载体为对照），并与miRNA-15a模拟物或无义miRNA共转染SKOV-3细胞。CCK8实验表明，与对照组相比，Wnt3a可显著增加SKOV-3细胞增殖能力（P＜0.05）；与转染miRNA-15a模拟物细胞相比，转入Wnt3a显著增加转染miRNA-15a模拟物的SKOV-3细胞增殖能力（P＜0.05，图5A）。Transwell侵袭实验结果显示，与对照组178.813±20.427相比，转入Wnt3a显著增加SKOV-3细胞的细胞侵袭能力293.733±26.932，差异具有统计学意义（t=5.889，P＜0.05）；与转染miRNA-15a模拟物的SKOV-3细胞的细胞侵袭能力143.667±13.052相比，转入Wnt3a显著增加转染miRNA-15a模拟物的SKOV-3细胞的细胞侵袭能力278.667±19.656，差异具有统计学意义（t=9.910，P＜0.05，图5B）。此之外，与转染miRNA-15a模拟物相比，转入Wnt3a后SKOV-3细胞中Wnt/βcatenin信号通路下游蛋白β-catenin和Cyclin D1蛋白的表达水平显著增加，且E-cad蛋白表达水平降低（均P＜0.05，图5C）。

图3 miRNA-15a模拟物对SKOV-3细胞中Wnt/β-catenin信号通路的影响

图4 miRNA-15a模拟物对SKOV-3细胞中Wnt3a基因的影响

图5 Wnt3a对SKOV-3细胞增殖、侵袭及Wnt/β-catenin信号通路的影响

3 讨论

卵巢癌的高复发率和易转移的特点导致患者的预后不良，生存率降低。因此，对肿瘤生长和转移相关机制的研究及寻找潜在的分子靶点就显得尤为重要。miRNA在转录后水平负调控基因的表达，在肿瘤的发生、发展中发挥重要作用［4-6］，已有研究发现，多种miRNA在卵巢癌中表达异常，作为癌基因或抑癌基因在其细胞生长、分化、浸润及转移过程中发挥重要作用［7-9］。其中miRNA-15a/miRNA-16-1簇是第一个证实与癌症相关的miRNA［10］。现已证实miRNA-15a在多种实体瘤中表达下调，作为抑癌基因发挥作用［11-12］。本研究结果表明，在卵巢癌组织中miRNA-15a低表达，与miRNA-15a在卵巢癌A2780和CP20细胞中低表达相一致［13］。进一步研究发现，miRNA-15a过表达显著抑制SKOV-3细胞增殖及侵袭，并促进细胞凋亡，提示miRNA-15a可作为抑癌基因抑制卵巢癌的生长和转移。

Wnt/β-catenin信号通路参与调控细胞分化、细胞迁移和生长，被认为是肿瘤发生的重要调控因子之一［14］。该信号通路被激活后，Wnt能够稳定并导致β-catenin大量积累。被激活的β-catenin进入细胞核，能够与TCF/LEF家族转录因子相互作用驱动下游靶基因的表达，如c-myc、Cyclin D1、VEGF、MMP-7、E-cad和AP-1转录激活因子等，均是参与细胞增殖和肿瘤发生的重要基因［15］。异常激活的Wnt/βcatenin信号通路能够促进细胞增殖及癌变，Wnt/βcatenin信号通路在大多数肿瘤细胞中过度激活，促进肿瘤细胞生长。Wnt3a能够促进β-catenin入核，进而促进下游蛋白Cyclin D1的表达，抑制E-cad的表达。本研究发现，过表达miRNA-15a能显著抑制Wnt/β-catenin信号通路的关键蛋白表达，如Wnt3a、β-catenin及其下游Cyclin D1和VEGF，上调E-cad表达，提示miRNA-15a过表达抑制卵巢癌细胞中Wnt/β-catenin信号通路的活化，抑制卵巢癌细胞增殖和侵袭。

miRNA通过调控靶基因的表达影响细胞学行为，一个miRNA能够调控多个靶基因，而每个靶基因又可受多个miRNA调控。有报道显示，miRNA-15a能够通过靶向Bmi-1调控卵巢癌OV-167、OV-202及CP-70细胞增殖［13］。另外，在卵巢癌OVSAHO和CP20细胞中ATP7B也是miRNA-15a的可能靶基因［12］。本研究通过荧光素酶报告基因实验及Western blot检测，从基因和蛋白水平上验证Wnt3a是miRNA-15a的靶基因，miRNA-15a能够靶向抑制Wnt3a表达。Wang等［8］研究表明，在子宫内膜癌中miRNA-15a通过靶向Wnt3a调控Wnt/βcatenin信号通路，从而调控细胞增殖。本研究通过上调SKOV-3细胞中Wnt3a表达，显著降低miRNA-15a对SKOV-3细胞增殖和侵袭的抑制作用。此外，上调SKOV-3细胞中Wnt3a表达还能增加β-catenin和Cyclin D1蛋白的表达，降低E-cad表达。以上研究证实，miRNA-15a通过靶向Wnt3a调控Wnt/β-catenin信号通路的活化，抑制卵巢癌的生长和转移。

综上所述，本研究发现在卵巢癌组织中miRNA-15a低表达，miRNA-15a通过靶向Wnt3a调控Wnt/βcatenin信号通路的活化，抑制卵巢癌的生长和转移，提示在卵巢癌中miRNA-15a可作为抑癌基因发挥功能，为卵巢癌的治疗提供了新的思路。