法卡林二醇单药及与其他药物联用对乳腺癌细胞凋亡的影响

芦婷婷，田欣，王竞

(1 中国医科大学附属第一医院，沈阳110001；2 中国医科大学附属盛京医院)

乳腺癌根据受体类型不同分为3种，即激素受体阳性、HER2阳性及三阴性，其中三阴性乳腺癌发病率最低。化疗是三阴性乳腺癌的主要治疗方法，但患者预后较差[1,2]。法卡林二醇(FAD)是一种从植物中提取的天然物质，具有抗炎、抗菌等作用。近期研究发现，FAD对肿瘤细胞具有杀伤作用[3,4]，其优势是可以在安全用量范围内杀死肿瘤细胞，但不会导致正常细胞死亡[5～8]。2012年1月～2016年9月，我们对乳腺癌细胞给予FAD单药或联合用药处理，旨在探讨FAD对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响。现报告如下。

1 材料

细胞系：人乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-468，正常乳腺细胞MCF-10，均购自美国ATCC。FAD购自上海皓元医药股份有限公司。MTT试剂盒，美国Thermo Fisher Scientific公司；5-氟尿嘧啶(5-Fu)、硼替佐米(BRZ)，美国Sigma公司。FACSCalibur流式细胞仪，美国BD公司。

2 方法与结果

2.2 细胞培养 将MDA-MB-231细胞、MDA-MB-468细胞、MCF-10细胞置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，每3～5天传代1次。

2.3 FAD对细胞增殖的影响 取对数生长期3种细胞，每种细胞分为5组，分别加入0、3、 6、12、24 μmol/L FAD作用24 h，采用MTT法检测细胞增殖率。结果显示，两种乳腺癌细胞在0、3、6、12 μmol/L FAD作用下细胞增殖率逐渐降低(P均<0.05)；24 μmol/L FAD作用下细胞增殖率低于0、3、6 μmol/L FAD(P均<0.05)，但与12 μmol/L FAD作用下比较P>0.05。正常乳腺细胞在各浓度FAD作用下细胞增殖率比较P均>0.05。见表1。考虑到干预效果及节省试剂的原则，我们选择3 μmol/L FAD进行后续研究。

表1 不同浓度FAD作用下三种细胞增殖率

2.4 FAD对细胞凋亡的影响 取对数生长期3种细胞，每种细胞分为FAD组和对照组，FAD组加入含3 μmol/L FAD的培养基培养，对照组常规培养，培养24 h，收集细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数) ×100%。结果显示，两种乳腺癌细胞的FAD组细胞凋亡率均高于其对照组(P均<0.01)，MCF-10A细胞的FAD组细胞凋亡率与其对照组比较P> 0.05。 见表2。

表2 两组细胞凋亡率比较

2.5 FAD与其他药物联合作用对细胞凋亡率的影响 选择乳腺癌细胞MDA-MB-231进行实验。第一组实验：将MDA-MB-231细胞随机分为空白组、5-Fu组、FAD组、5-Fu+FAD组。空白组常规培养，5-Fu组加入含25 μmol/L 5-Fu的培养基培养，FAD组加入含1 μmol/L FAD的培养基培养，5-Fu+FAD组加入含25 μmol/L 5-Fu及1 μmol/L FAD的培养基培养，培养24 h，收集细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示，空白组细胞凋亡率为(3.50±0.26)%、5-Fu组为(10.43±0.15)%、FAD组为(20.43±0.12)%、5-Fu+FAD组为(50.63±0.25)%，5-Fu组、FAD组、5-Fu+FAD组均高于空白组(P均<0.01)，5-Fu+FAD组高于5-Fu组和FAD组(P均<0.01)，而5-Fu组与FAD组比较P>0.05。第二组实验：将MDA-MB-231细胞随机分为空白组、BRZ组、FAD组、BRZ+FAD组。空白组常规培养，5-Fu组加入含25 μmol/L 5-Fu的培养基培养，BRZ组加入含10 nmol/L BRZ的培养基培养，BRZ+FAD组加入含10 nmol/L BRZ及1 μmol/L FAD的培养基培养，培养24 h，收集细胞，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果显示，空白组细胞凋亡率为(3.30±0.20)%、BRZ组为(40.40±0.26)%、FAD组为(20.63±0.23)%、BRZ+FAD组为(85.4±0.26)%，BRZ组、FAD组、BRZ+FAD组均高于空白组(P均<0.01)，BRZ+FAD高于5-Fu组和FAD组(P均<0.01)，而5-Fu组与FAD组比较P>0.05。

3 讨论

研究证实，FAD的作用机制与细胞自噬有关[9]。FAD可抑制蛋白酶体的功能，诱导蛋白累积，最终导致内质网应激发生，进而发挥杀伤并抑制肠癌细胞增殖的作用[10]。本研究观察了FAD对乳腺癌细胞增殖及凋亡的影响，结果发现，随着FAD浓度升高，其对乳腺癌细胞的杀伤作用增强，且3～12 μmol/L时效果最佳；但其对正常乳腺细胞并无杀伤作用。提示FAD可用于治疗乳腺癌，且对正常乳腺细胞影响小，药物毒副作用可能较低。

5-Fu是治疗恶性肿瘤的一线药物，主要药理作用是通过干扰DNA合成诱导肿瘤细胞凋亡。5-Fu目前广泛用于胃肠、头颈部、胸部、卵巢等部位肿瘤治疗，但其胃肠道反应、骨髓抑制、脱发及肝肾功能损害等毒副作用大，患者耐受性较低[11]。BRZ可通过泛素-蛋白酶体通路诱导肿瘤细胞凋亡，与化疗及放疗联合可发挥协同抗癌作用[12]。本研究分别将FAD与5-Fu或BRZ联合应用于乳腺癌细胞，结果显示，联合用药可提高FAD促肿瘤细胞凋亡的作用，且FAD用药剂量降低，仅1 μmol/L；提示FAD可与5-Fu、BRZ等抗肿瘤药物产生协同作用。肿瘤细胞内压力高，需要更多的压力支持通路才能得以生存，因此更易受到超负荷的影响[13]。协同作用就是通过应力的致敏及过载提高杀伤作用。这可能是FAD与5-Fu或BRZ协同作用的原理。此外，FAD与5-Fu还能诱导内质网应激及DNA合成障碍[14,15]，而BRZ可通过干预内质网相关降解导致内质网应激发生，这些也可能是FAD与5-Fu、BRZ联用产生协同作用的原因。

综上所述，FAD可促进乳腺癌细胞凋亡并抑制其增殖，但不影响正常乳腺细胞；FAD联合5-Fu或BRZ对促进乳腺癌细胞凋亡的效果优于FAD单药。