HPLC 法测定芪五加颗粒中紫丁香苷的含量

陈文云，钟水燕，范传园

（1.江西省兽药饲料监察所，南昌330029；2.江西中成中药原料有限公司，南昌331700）

芪五加颗粒是依据《中药部颁标准》第6册第42页“北芪五加片”的处方、工艺制成的改剂型产品，由黄芪浸膏、刺五加浸膏组方制成的颗粒剂。具有益气，健脾，安神功能，用于家禽免疫低下等。根据有关文献[1]，方中黄芪含有皂苷类等有效成分，《中国兽药典》收载的HPLC法测定黄芪中的黄芪甲苷采用蒸发光散射器检测器，适用性、普遍性、经济性不高。另根据文献报道[2]采用柱前衍生化法，研究了本品黄芪甲苷柱前衍生化含量测定方法，结果回收率、精密度、重现性等指标均不符合要求。方中另一味中药刺五加，其有效成分为紫丁香苷，关于紫丁香苷的HPLC测定方法已有很多文献报道[4-6]。为有效控制产品质量，建立HPLC法测定芪五加颗粒中紫丁香苷的含量，并进行方法学考察，结果表明该方法简便快速，重现性、稳定性较好，精密度较高，可作为该制剂的定量控制指标。

1 仪器和试药

1.1 仪器 SyltechLC500高效液相色谱仪（赛尔泰（杭州）科技有限公司）；浙大N2000色谱数据工作站；92SM-202A-DR电子天平 （上海普利塞斯国际贸易有限公司）；MA110电子天平（上海良平仪器仪表有限公司）；101-1AB型电热恒温鼓风干燥箱（北京科伟永兴仪器有限公司）；超声波提取器 JL180（220V，50HZ）。

1.2 试药 芪五加颗粒（批号2011050601、2011050801、2011051001），其中黄芪浸膏的工艺来源于“北芪五加片”附注黄芪浸膏的制法，刺五加浸膏的工艺依照文献[3]，颗粒剂的成型工艺由江西中成中药原料有限公司研究；紫丁香苷对照品（111574-200502，供含量测定用）购自中国药品生物制品检定所；乙腈为色谱纯，购自上海精细化工有限公司公司；水为二重蒸馏水；其它试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱：迪马Diamonsil C18（5μm×250mm×4.6mm）；流动相：乙腈-水-冰醋酸（10：90：1）； 流速：1.0mL/min； 检 测波长265nm；进样量20μL；理论塔板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取紫丁香苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。2.3供试品溶液的制备 取本品，研细，混匀，取约5g，精密称定，置 25ml量瓶中，加甲醇 20ml，超声处理30分钟，放冷，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察 精密称取紫丁香苷对照品12.97mg置于100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取2.0、4.0、8.0、12.0、20.0mL置于25mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即分别得浓度为 10.376、20.750、41.504、62.256、103.760μg·mL-1。按上述色谱条件，分别进样20μL，记录峰面积积分值，以紫丁香苷峰面积积分值（Y）为纵坐标、紫丁香苷进样量（X）为横坐标绘制标准曲线（见图1），计算，得回归方程y=3E+06x+601081（r=0.9991，n=5）。结果表明紫丁香苷含量在为0.2075～2.075μg范围内，与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件重复进样5次，每次20μL，分别测定峰面积积分值，相对标准偏差为1.12%，表明进样方法的仪器精密性可达到测定要求。

2.6 重现性试验 准确称取同一批芪五加颗粒（批号 2011050601）样品 5 份，分别按“2.3”项下方法处理后进样20μL，结果紫丁香苷峰面积积分值相对平均偏差为1.26%，表明样品处理方法重现良好。

2.7 稳定性试验 取同一对照品溶液和同一供试品溶液， 分别在 0、4、8、12、24 小时进样测定，紫丁香苷对照品峰面积积分值的RSD%为1.14%（n=5），供试品紫丁香苷峰面积积分值的RSD%为1.22%（n=5），说明紫丁香苷至少在24小时内稳定。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的芪五加颗粒（批号2011050601）5份，每份约5.0g，精密称定，于每份中分别精密加入紫丁香苷对照品溶液，按供试品溶液的制备方法制备，以上述的色谱条件下，吸取供试液20μL进样，依法测定，计算回收率。结果平均回收率97.91%，RSD=0.97%（n=5）。结果（见表1）。

表1 加样回收率试验结果

2.9 样品测定 取样品3批，按“2.3”项下方法制备供试品溶液并按“2.1”项下色谱条件，对照品溶液与供试品溶液各进样20μL，分别测定紫丁香苷含量（见表2）。

表2 样品中紫丁香苷的含量（n=3）

图1 -标准曲线

图2 -紫丁香苷对照

图3 -芪五加颗粒样品

图4 -芪五加颗粒样品

3 讨论

3.1 流动相的选择 先参照文献[3]收载的刺五加药材和刺五加浸膏中紫丁香苷的HPLC含量测定方法，流动相为甲醇：水（20∶80），结果表明芪五加颗粒中紫丁香苷的峰型前延，分离度较差(见图4)。后根据文献报道[4-6]，比较不同比例的乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸、甲醇-水-磷酸、乙腈-水-磷酸等多种溶剂系统作为流动相进行考察，结果以乙腈-水- 冰醋酸（10∶90∶1）为流动相，所得紫丁香苷峰形良好，峰形尖锐且对称性好，分离度高，效果较好(见图 2、3)。

3.2 测定波长的选择 通过对紫丁香苷对照品溶液进行全波长扫描，在265nm处有最大吸收。并参考有关文献[4-6]，紫丁香苷在265nm处有最大吸收，且紫丁香苷峰基本无干扰，故选择265nm为检测波长。

3.3 供试品处理方式的选择 通过比较水、甲醇、10%甲醇、50%甲醇、乙醇、60%乙醇、正丁醇为提取溶剂，结果采用甲醇作为提取溶剂提取率最高，效果最好。考察了超声处理10min、20min、30min、1h及加热回流30min、1h，结果表明超声30min，紫丁香苷基本提取完全且杂质相对比回流的量要少，故定供试品的提取方法为超声30min。

3.4 结论 本文采用高效液相色谱法测定了芪五加颗粒中紫丁香苷的含量，操作简便，结果准确，可以作为芪五加颗粒的质量控制指标。