痤疮散微生物限度检查方法的适用性试验研究

简晓莉，刘志承，李曙光，刘纪青

（广东省深圳市中医院，广东 深圳 518033）

痤疮散为我院临床应用20多年的院内制剂，有清热、祛风、杀虫等作用，主要用于治疗痤疮，外用疗效显著［1－3］。2015 年版《中国药典（四部）》的微生物限度检查法结合国情、参考欧美药典进行了修订，与2010年版《中国药典》的方法相比，在培养基、培养条件和检验方法上均有重大改进［4］。为了提高痤疮散的质量标准，确保医院制剂的用药安全，本研究中根据2015年版《中国药典（四部）》［5］微生物限度检查法中的相关规定，对痤疮散的微生物限度检查法进行重新修订，并进行了适用性试验。现报道如下。

1 仪器、试药与材料

1.1 仪器

TX323L型电子天平（日本岛津公司）；LMQ.C型高压蒸汽灭菌器（山东博科生物产业有限公司）；SPX－150BY－Ⅱ型生化培养箱（北京鑫腾达仪器设备有限公司）；HH.B11.500－BY －Ⅱ型电热恒温培养箱（广州永程科学设备有限公司）；电恒温水浴锅（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；1300 A2型生物安全柜（赛默飞世尔科技＜中国＞有限公司）。

1.2 试药

痤疮散（深圳市中医院院内制剂，批号分别为20160223，20160303，20160309）；胰酪大豆胨琼脂培养基 （TSA，批号为 3105210），沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA，批号为3105268），胰酪大豆胨液体培养基（TSB，批号为3105171），沙氏葡萄糖液体培养基（SDB，批号为3105054），甘露醇氯化钠琼脂培养基（批号为3105175），溴化十六烷基三甲琼脂培养基（批号为3105130），无菌氯化 －蛋白胨缓冲液（pH ＝7.0，批号为 3105256），均购自广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 试验菌株

金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、铜绿假单胞菌［CMCC（B）10104］、枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、黑曲霉［CMCC（F）98003］菌种，均购自中国食品药品检定研究院，且均使用第3代培养物。

2 方法与结果

2.1 微生物计数法适用性试验

2.1.1 菌液制备

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌：取TSB新鲜培养液，稀释至不大于100 cfu／mL，备用。

白色念珠菌：取SDB新鲜培养液，稀释至不大于104cfu／mL 及不大于 100 cfu／mL，备用。

黑曲霉：取孢子悬液，稀释至不大于104cfu／mL及不大于100 cfu／mL，备用。

2.1.2 供试液制备

从2个（或以上）包装中取本品10 g，加稀释液至100 mL，45 ℃保温振摇使其分散均匀（pH ＝6.5），静置，取上清液，得1∶10供试液；取1∶10供试液，分别稀释成 1 ∶20，1 ∶50，1 ∶100的供试液。

2.1.3 供试液中微生物的回收

需氧菌总数（平皿倾注法）：试验组取无菌试管5 支，分别加 2.1.2 项下制备的供试液各 9.9 mL 及2.1.1 项下制备的菌液各 0.1 mL，混匀，取 1 mL 置无菌平皿中，倾注TSA依法培养、计数，每株试验菌平行制备2个平皿。供试液对照组取无菌试管1支，以稀释液替代菌液，同试验组操作。菌液对照组取无菌试管5支，以稀释液替代供试液，同试验组操作。

需氧菌总数（薄膜过滤法）：试验组取2.1.2项下制备的1∶20供试液的上清液1 mL，加至装有100 mL pH＝7.0无菌氯化钠蛋白胨缓冲液过滤器中（φ75 mm滤膜），混匀，滤尽，再按 300 mL／膜（冲洗 3次，每次100 mL）的冲洗量冲洗，在最后100 mL冲洗液中各加2.1.1 项下制备的菌液 1 mL（不大于 100 cfu ／mL），取滤膜依法培养、计数。供试液对照组除不加菌外同试验组操作。菌液对照组以稀释液替代供试液，同试验组操作。

霉菌和酵母菌总数（平皿倾注法）：试验组取无菌试管 2支，分别加 2.1.2项下制备的 1∶10，1∶20供试液9.9 mL及2.1.1项下制备的白色念珠菌及黑曲霉菌液各0.1 mL，混匀，取1 mL于无菌平皿中，倾注SDA依法培养、计数，每株试验菌平行制备两个平皿。供试液对照组取无菌试管1支，以稀释液替代菌液，同试验组操作。菌液对照组取无菌试管2支，以稀释液替代供试液，同试验组操作。

2.1.4 微生物回收率计算

微生物回收率＝（试验组菌落数－供试液对照组菌落数）／菌液对照组菌落数×100%。结果见表1和表2。

表1 需氧菌总数计数适用性试验回收率（%）

表2 真菌和酵母菌总数计数适用性试验回收率（%）

2.2 控制菌检查法适用性试验

2.2.1 菌液制备

金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌：取TSB新鲜培养液，稀释至不大于100 cfu／mL，备用。

2.2.2 金黄色葡萄球菌检查方法适用性试验

增菌培养：试验组取 100，200，500 mL TSB，加2.1.2项下制备的 1 ∶10供试液 10 mL 及 2.2.1 项下制备的金黄色葡萄球菌1 mL，混匀，依法培养18～24 h。供试液对照组以稀释液代替菌液，同试验组操作。阴性对照组以稀释液替代供试液及菌液，同试验组操作。

选择和分离培养：取增菌培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72 h。

2.2.3 铜绿假单胞菌检查方法适用性试验

增菌培养：试验组取 100 mL TSB，加 2.1.2项下制备的1∶10供试液10 mL及2.2.1项下制备的铜绿假单胞菌1 mL，混匀，依法培养18～24 h。供试液对照组以稀释液代替菌液，同试验组操作。阴性对照组以稀释液替代供试液及菌液，同试验组操作。

选择和分离培养：取增菌培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72 h。结果见表 3。

表3 金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌适用性试验结果

3 讨论

本品剂型为散剂，在需氧菌总数薄膜过滤法试验中，1∶10供试液上清液易吸入药品粉末，过滤困难，经纱布过滤仍难以改善，故取1∶20供试液进行薄膜过滤法方法适用性试验。

本品由大黄、黄连、白芷、防风等9味药组方，这些药物成分对微生物均有抑制作用［6－15］。3批样品的验证试验结果表明，本品对需氧菌中的枯草芽孢菌、白色念珠菌有抑制作用，对金黄色葡萄球菌有较强抑菌性。采用1∶100稀释级供试液进行平皿法试验，金黄色葡萄球菌几乎没有回收。采用薄膜过滤法，用300 mL pH＝7.0的氯化钠－蛋白胨缓冲液冲洗即可消除其抑菌作用，回收率在2015年版《中国药典（四部）》附录规定的50%～200%之间，说明薄膜过滤法应用于本品需氧菌总数的微生物检查具有可行性。由表2可见，本品对霉菌及酵母菌总数中的白色念珠菌有微弱的抑菌性，采用1∶20供试液进行平皿法试验能消除其抑菌性，2种试验菌均在2015年版《中国药典（四部）》附录规定的50% ～200%之间，方法可行。控制菌方法验证试验结果表明，本品对金黄色葡萄球菌有较强抑制作用，加入100 mL及200 mL培养液，试验组仍无菌生长，需加培养液至500 mL才能消除其抑菌性。由表3可见，采用常规方法检查痤疮散中的铜绿假单胞菌，试验组为阳性，方法可行。本方法验证结果准确、可靠、重复性好，可用于痤疮散的微生物限度检查。