微载体规模化培养PK-15细胞增殖猪圆环病毒2型LG株的研究

猪圆环病毒2型（Porcine drcovirus type 2，PCV2）可导致动物机体免疫系统功能严重受损，形成免疫抑制，增强对其它多种病原体的易感性，使猪群发生难以控制的复发性疾病和多重感染。目前该病呈全球性流行，给养猪业造成巨大经济损失。疫苗生产时的培养方式依然延用了传统的转瓶培养方式，工序操作繁琐，批间与瓶间细胞生长状态的差异导致PCV病毒滴度的不稳定。

生物反应器微载体悬浮培养其营养物质的传递更加充分均匀，细胞生长及病毒增殖的培养环境相对优质、恒定，整个培养过程控制精确，易于重复，疫苗产品质量均一性高等独特优势，受到越来越多疫苗企业关注。本研究使用7L生物反应器进行PCV2的培养，旨在进行生物反应器微载体培养PCV工艺的摸索，为进一步使用大容积生物反应器微载体进行PCV的培养奠定基础。

一、材料与方法

1.细胞、种毒及微载体。PK-15细胞为哈药集团生物疫苗有限公司保存；PCV2-LG株为哈尔滨兽医研究所猪病研究室提供；Cytodex 1微载体购自美国GE公司。

2.主要试剂及仪器。胎牛血清购自美国CLARK公司；DMEM培养基购自美国GIBCO公司；7L细胞生物反应器购自荷兰Applicon公司；猪圆环病毒2型抗原检测试剂盒购自哈尔滨兽医研究所；其余试剂为分析纯。

3.PK-15细胞微载体培养。将处于对数生长期的PK-15细胞用胰酶消化脱壁，加入含10%新生牛血清的MEM营养液重悬并计数。在250 ml搅拌瓶中分别加入浓度为1、3和5 g/L的微载体（按照产品说明书进行水化及灭菌处理），细胞初始接种密度为0.3×106cells/ml，每天取样进行细胞计数，即吸取摇匀后的细胞悬液1 mL置于EP管中，1 000 r/min，离心5 min后弃上清，加入1 ml 1%结晶紫溶液并混匀，37℃孵育1 h后，用移液枪吹打使微载体上的细胞脱落并保证细胞核全部释放，稀释后用血球计数板计数释放的细胞核，即为细胞密度，并绘制细胞生长曲线。

4.不同接毒时间对病毒滴度的影响。将PK-15细胞以0.3×106cells/ml的密度接种于250 ml搅拌瓶中，微载体用量为3 g/L。分别在细胞生长0 h、6 h和12 h，以MOI为0.05接种PCV病毒，接毒后48 h，用无血清的MEM培养液换液1次，继续培养，接毒后每24 h取样测定PCV的效价。

5.接种不同MOI病毒对病毒滴度的影响。将PK-15细胞以0.3×106cells/ml的密度接种于250 ml搅拌瓶中，微载体用量为3g/L。待细胞生长6 h后，分别以MOI为0.01、0.05和0.2接种PCV2病毒，接毒后48 h，用无血清的MEM培养液换液1次，继续培养。接毒后每24 h取样测定PCV的效价，确定最佳收获病毒时间。

6.生物反应器培养接种PCV2。根据搅拌瓶中摸索的病毒增殖工艺，在7L生物反应器中验证其工艺的可行性。微载体用量为3g/L，细胞接种密度为0.3×106cells/ml，细胞接种6 h后以MOI为0.05接种PCV2病毒，接毒后48 h，用无血清的MEM培养液换液1次，继续培养72 h收获病毒液。生物反应器操作参数控制为DO 50%，搅拌速度100 r/min，温度37℃，pH值7.2。

7.IPMA法检测PCV病毒滴度。将病毒液用无血清MEM细胞培养液做10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-63个稀释度，各接种96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，每孔100μl，同时设6孔无病毒作为健康细胞对照。每孔加入100μl新消化的PK-15细胞悬液，培养液为含10%新生牛血清的MEM。培养48 h，待细胞长满单层，用冷的甲醇固定，一抗为PCV2抗体，二抗为FITC荧光抗体，AEC底物显色液室温显色，置显微镜下观察染色结果。结果判定：阳性细胞孔内可观察到阳性细胞的胞浆或胞核内有典型的红棕色着染，而阴性对照、空白对照的细胞孔内无红棕色着染。

二、结果

1.不同浓度微载体对PK-15细胞生长的影响。当初始细胞密度为0.3×106cells/ml，微载体用量分别为1、3和5 g/L时，PK-15细胞在微载体上生长曲线如图1所示。微载体浓度为1 g/L时，细胞快速进入生长期，但由于接种后细胞存在聚团和游离细胞不黏附的现象，虽然单个微载体上分配的细胞个数很多，但不能提供有效的黏附生长表面，不利于细胞生长。微载体浓度为5 g/L时，PK-15细胞的延迟期延长，这是由于单个微载体上分布的细胞过少，细胞生长缺乏初始密度效应而造成生长相对缓慢，最大细胞密度也最低。所以最合适的微载体浓度为3g/L，能均匀分布细胞于每个微载体表面，促使细胞快速生长，同时也为细胞的生长预留了充裕的生长表面，最终获得较好的培养效果。

图1 不同浓度微载体PK-15细胞生长曲线

2.不同接毒时间对病毒滴度的影响。不同接毒时间对PCV2增殖效价的影响结果如表1所示。分别在细胞培养后0、6和12小时接种病毒，其所对应的最高病毒滴度分别为106.5、106.5和106.5。细胞接种后6 h接种PCV2为最佳接毒时间，其收获的最大病毒滴度显著高于其余两组。虽然理论上细胞数越多，其所收获的病毒也应该最多，但PPV病毒只在一定范围内满足此规律，说明细胞密度并不是决定病毒滴度的决定性因素，而是细胞的生长状态。

表1 不同接毒时间对病毒滴度的影响

3.接种不同MOI病毒对病毒滴度的影响。不同感染复数对PCV2增殖效价的影响结果如表2所示。过高或过低的感染复数（0.2和0.01）均导致较低的PCV2增殖效价，说明接毒剂量直接影响病毒的增殖效率。感染复数为0.05 h可以获得较高的PCV2增殖效价，达到106.5TCID50/ml。此外各组试验结果均显示，随着培养时间增加病毒毒价逐渐升高，说明换液后72 h可以作为收获病毒的最适时间。

表2 接种不同MOI病毒对病毒滴度的影响

4.7 L生物反应器培养接种PCV2。对7 L生物反应器培养PCV2进行病毒滴度测定，各时间病毒滴度如表3所示。与250 ml搅拌瓶病毒增殖趋势相同，病毒滴度也是随着时间增加逐渐升高，接毒72 h病毒滴度达最高值。

表3 7L生物反应器中PCV2病毒滴度

三、讨论

在细胞微载体悬浮培养的初期，细胞与微载体的接触及黏附是一种物理性碰撞过程，控制合适的微载体与初始细胞量的比例可以达到较好的培养效果。本研究中发现微载体浓度过小会增加传代次数，不符合生产经济性；微载体浓度过大时，培养过程中微载体相互聚集、碰撞，使死细胞数量增加。微载体浓度为3 g/L时可以获得均匀的细胞分布效果，细胞黏附充分，并预留了适度的细胞生长空间，细胞增殖密度和细胞存活率均获得最好的水平。

选择合适的接毒时间至关重要，进行PCV2培养时，应在细胞接种或未形成单层之前接种。细胞接种后0 h以MOI为0.05接种PCV2病毒，接种病毒时间较早，严重影响了细胞的正常生长，病毒毒价较低；细胞接种后12 h以MOI为0.05接种PCV2病毒，细胞密度有所提高，虽然理论上细胞数越多，其所收获的病毒也应该最多，但病毒毒价并没有细胞接种后6 h接种PCV2高。说明细胞密度并不是决定病毒滴度的决定性因素，而是细胞的生长状态。这主要是由于PCV2病毒在增值子代病毒时需要宿主细胞DNA复制相关的酶参与，只有细胞处于指数生长前期时其DNA复制酶的活性最局，数量最多。

本研究摸索了利用微载体规模培养PK-15细胞增殖PCV2 LG株的条件，根据试验结果确定最佳接毒时间为细胞接种后6 h，最佳接毒剂量为MOI=0.05，在此条件下增殖病毒含量最高可达106.5，表明PCV2 LG株适应在PK-15细胞内大规模增殖，为以哺乳动物细胞为基质大规模增殖病毒及制备猪圆环病毒疫苗提供依据。

参考文献（略）