家兔尸斑吸光度与死亡时间的关系

马远斌 胡丙杰

1中山大学中山医学院法医病理学教研室（广州 510080）；2广州医科大学基础学院病理学教研室法医学组（广州 511436）

准确的死亡时间（postmortem interval，PMI）推断对划定侦察范围、确定和排除犯罪嫌疑人、财产继承及保险理赔等方面都有非常重要的意义。尸斑在死亡时间推断方面被广泛应用，但以往主要根据尸斑的颜色和分布、指压是否裉色等肉眼观察的方法进行推断，缺乏客观性［1⁃3］。关于尸斑的客观测量方法研究较少［4⁃10］。KAATSCH［4⁃5］和VANEZIS［6］用三色色度计对尸斑进行研究发现尸斑颜色的变化数值与死亡时间之间有相关，IN⁃OUE［7］利用近红外光吸收血液成分的原理设计测量尸斑程度的仪器，用普通光630 nm作为特征峰，发现测量数值与死亡时间之间相关性较好。但上述研究结果并不理想，实验方法针对性较差，推断的准确性也较低。本研究旨在研制出便携式仪器，改进测量方法，利用动物实验，将影响因素控制到最小，以期提高尸斑用于死亡时间推断的准确性。

1 材料与方法

1.1 尸斑的动物模型制作家兔8只，体质量2.5～3.0 kg（中山大学动物实验中心提供），在室内空调温度设定25℃，通风橱与外界相通的环境条件下，通过机械性窒息方式处死后，用8%的硫化钠酒精溶液对家兔颈、胸、腹三处进行整体脱毛，仰卧位平衡放置于通风橱内，即完成动物模型制作。

1.2 尸斑测量仪器的设计制作

1.2.1 尸斑吸光度测量仪的设计、工作原理以及使用方法由上海仪器仪表研究所进行研制。当仪器开机后，电压调整电路DC⁃DC直流变换器开始工作，向氙管提供能量，轻按仪器探头，触发开关，致使氙管闪光，光线通过光导纤维探头的外环部分照射到被测量皮肤处，而后反射光经光导纤维内环传导回仪器内部滤光片，反射光中500～600 nm光线通过滤光片后传到光电管，再由光电转换电路再送到门电路，通过计数电路由状态控制电路控制，把测得的数据显示出来。按一下复位键，原显示数据清隐，过5 s左右，Ready指示发光管亮后，可进行第二次测试。

1.2.2 尸斑分光光度计验证步骤取10 mL家兔颈动脉血置于抗凝管中，用尸斑分光光度计仪器探头在抗凝管管底对血液进行吸光度值的测定，通过观察吸光度值的变化与死亡时间的关系来判断仪器的有效性。

1.3 尸斑的分光光度法测量家兔尸斑吸光度步骤

1.3.1 测量位置和测量点的选择选择尸斑明显处（中背部和侧背部）和尸斑不明显甚至缺乏处（胸前、季肋上、季肋下、腹正中、侧腹部和背压部）共8个部位27个测量点作为测量点，其中：胸前2个点（剑突上0.5 cm位置及剑突上方2 cm位置，分别称为胸前点、胸上点）；季肋上4个点（为季肋起点处、中点处，分别称为左上季肋点、左中季肋点、右上季肋点、右中季肋点）；季肋下2个点（为季肋终点处，分别称为左下季肋点、右下季肋点），腹正中线3个点（腹正中线上平第二、三、四对乳头处，分别称为腹上点、腹中点及腹下点），侧腹4个点（两侧第二三乳头中点处及第三四乳头中点处，分别称为左上腹点、左下腹点、右上腹点及右下腹点）；背压部4个点（背脊对应侧腹相应点位置水平脊柱旁1 cm处，分别称为左上背压点、左下背压点、右上背压点及右下背压点）；中背部4个点（对应背压部两个点水平脊柱旁3 cm处，分别称为左上背点、左下背点、右上背点及右下背点）；侧背部4个点（对应背压部脊柱旁5 cm处，分别称为右上侧背点、左下侧背点、右上侧背点及右下侧背点）。

1.3.2 测量时间点的选择死亡后4 h内每1 h测量1次，第5～56 h内每2 h测量1次。

1.3.3 测量方法用尸斑吸光度测量仪在每个测量点测量3次，测量手法是用仪器的探头平放于测量位置，然后将探头轻轻下压，触发开关激发氙光管闪光，读数后即完成1次测量。

1.3.4 统计学方法先求出同一时间在同一测量点3次测量值的平均数，再求出同一测量位置的平均数，再将8只家兔的每次均数进行统计，求出总均数以及其95%可信区间等，然后进行8个测量位置吸光度值与死亡时间全程56 h以及分段的单因素回归分析和多因素回归分析，并求出回归方程。

2 结果

2.1 尸斑分光光度计验证新鲜血液放在比色管中，红细胞等密度最大的成分向管底沉降，速度为先快后慢，最后基本稳定。本实验中随时间延长，仪器测得的血液吸光度值亦随之增加，在16 h内呈先快后慢最后稳定不变（图1）。

图1 尸斑吸光度测量仪测得的血液沉降时间图Fig.1 Light absorption value for blood sedimentation plotted against measurement time

2.2 8个测量位置吸光度值相对于死亡时间的散点图见图2。

2.3 统计分析

2.3.1 8个测量位置吸光度值与死亡时间的单因素回归分析用SPSS 10.0软件包对死亡56 h内各测量位置吸光度值与死亡时间进行单因素回归分析，结果表明：以死亡时间（PMI）大小为因变量（Y），以8个测量位置吸光度值为自变量（X）进行相关及回归分析，给定α=0.05，结果：8个测量位置吸光度与死亡时间均存在相关，相关性大小依次为侧背均，中背均，腹中均，侧腹均，背压均，胸前均，季下均，季上均；相关性最强的是中背均，其确定系数R2=0.552，回归方程为Y=2.352X⁃10.331。

2.3.2 多元逐步回归分析

2.3.2.1 总体数据多元回归分析用SPSS 10.0软件包对死亡56 h内各测量位置吸光度值与死亡时间进行多元回归分析，结果表明：以死亡时间（PMI）大小为因变量（Y），以单因素分析筛选出的因素为自变量（Xn）进行多元逐步回归分析，进行回归方程的变量共有5个，有侧背均（X1）、中背均（X2）、季肋上均（X3）、侧腹均（X4）及胸前均（X5），回归方程如下：Y＝-10.627＋0.819X1＋1.380X2-2.385X3＋2.502X4-0.801X5，R2=0.736。

2.3.2.2 分段时间多元回归分析以死亡时间（PMI）大小为因变量（Y），以单因素分析筛选出的因素为自变量（Xn）进行多元逐步回归分析，给定α=0.05，结果如下：

图2 家兔死后56 h内吸光度平均值随时间变化图Fig.2 Light absorption value of 8 rabbits with different post⁃mortem intervals plotted against measurement time

2.3.2.2.1 死亡8 h内进入方程的变量有中背均（X1）、季肋上均（X2）、背压均（X3），Y=0.253＋0.570X1-0.739X2＋0.261X3，R2=0.728。

2.3.2.2.2 死亡8～32 h进入方程的变量有中背均（X1）、季肋上均（X2）、侧腹均（X3）、背压均（X4）及季肋下均（X5），Y=6.462+1.283X1-3.748X2＋2.971X3-1.293X4＋1.267X5，R2=0.626。

2.3.2.2.3 死亡32～56 h进入方程的变量只有侧背均（X），Y=28.326＋0.824X，R2=0.370。

3 讨论

3.1 尸斑吸光度测量仪的有效性和先进性尸斑是指尸体血液循环停止后，血管内的血液由于自身重力，开始从尸体的高位流向低位，坠积在未受压迫部位的血管中，使该处毛细血管扩张，充满血液，并透过皮肤显示出边缘不清的血红蛋白颜色的斑痕。由于红细胞（包括血红蛋白）在血液各种成分中密度最大，所以尸斑的形成过程从某种程度上来说主要是红细胞等从尸体高位坠积到低下未受压迫部位，随着死亡时间延长，尸体低下部位红细胞等增加，对特征峰的吸光度上升，而尸体高位红细胞减少，对特征峰的吸光度下降。由于在500～600 nm范围内，人体血液主要成分中仅红细胞及血红蛋白（包括氧合血红蛋白、还原血红蛋白等）有吸收峰，而血浆、白细胞、血小板、淋巴细胞及血清胆红素等其它血液成分在此范围均无吸收峰，而且在此光谱范围受黑色素和人体最大成分水的干扰亦较少［7，11］，因此通过测量相关部位血液在500～600 nm范围的吸光度即可以客观地对尸斑进行检测。据此，笔者使用仅吸收500～600 nm范围光的滤光片，研制出便携式的尸斑吸光度测量仪（由上海仪器仪表研究所研制的婴幼儿黄疸测量仪改制而成），对血液沉降的吸光度测量结果表明，随着时间延长，仪器测得的血液吸光度值亦随之增加，在16 h内呈先快后慢最后稳定不变。这与尸斑的形成过程类似，因此，该仪器可以对血液的沉降进行检测。

尸斑出现时间的早晚与死亡当时血液的量和性状有极大关系。由于试管内血液量只有10 mL，影响因素单一，故在放置16 h血液沉降过程已经完成。而动物或尸体血液量大且广泛分布在血管和器官组织内，尸斑形成过程中影响血液坠积和重新分布的因素非常复杂（如器官致密程度、血管分布与走向等），血液坠积过程难以在16 h内完成，因此其曲线形态有较大不同。在死亡24 h后，所谓尸斑已经“固定”是指指压尸斑不退色而言，但随着死亡时间的延长，高位血液的坠积并未停止，因此本实验中在死后56 h仍可检测家兔尸斑部位吸光度变化。

3.2 实验结果分析

3.2.1 单因素回归分析对56 h内8个测量位置尸斑吸光度值与死亡时间的单因素回归分析显示，8个测量位置吸光度值推断死亡时间的准确性不同。尸斑最明显的低下未受压部位（中背部和侧背部）是推断死亡时间最好的部位，但其他6个测量位置的吸光度值与死亡时间也存在相关关系，这提示我们，传统的只对尸斑最明显的部位，也就是尸体低下非受压部位的尸斑进行测量是不完全的，对尸体侧面甚至腹面的非尸斑处进行测量也可以用来推断死亡时间。

3.2.2 多元回归分析将家兔死亡56 h内各测量位置吸光度值与死亡时间进行多元回归分析，得出的多元回归方程的R2=0.736，明显高于VANEZ⁃IS［6］（R2=0.289）和 INOUE［7］（R2=0.563）的实验结果，大大提高了推断死亡时间的准确性，并可用于死后较长时间的死亡时间推断，印证了KAATSCH［4⁃5］和 VANEZIS［6］的结论。究其原因，一方面是由于我们采用了更有特征性的吸收光谱（包含红细胞和血红蛋白的特征性吸收峰的宽光带），另一方面是因为除对尸斑最明显的部位进行测量外，我们还将尸斑不明显处，甚至缺乏处也同时进行测量，通过测量尸体高位的红细胞（包括血红蛋白）的减少和低下未受压迫部位红细胞（包括血红蛋白）的增加来综合考虑推断死亡时间（单一利用尸斑最明显的中背处，其R2=0.552，综合考虑后R2=0.736）。

3.2.3 分时间段单因素回归分析对8个测量位置吸光度值与死亡时间的单因素回归分析显示，死亡8 h内，躯体低下部位（中背、侧背以及背压部）的吸光度值与死亡时间有正相关，而侧面及躯体较高位置的吸光度值与死亡时间没有相关关系；死亡10～32 h，躯体较高位置（胸前、季肋上、季肋下）和躯体受压位置（背压部）的吸光度值与死亡时间之间亦没有相关关系，而腹中部、腹侧部以及躯体低下未受压部位的吸光度值与死亡时间有正相关关系；死亡34～56 h，8个测量位置的吸光度值与死亡时间之间均存在着正相关关系，推断的准确性依次为：侧背均、侧腹均、中背均、腹中均、季上均、背压均、胸前均以及季下均，对推断影响最大的还是低下非受压部位（侧背、中背）。死亡8 h内回归方程的R2=0.728，10～32 h内回归方程的R2=0.626，34～56 h内回归方程的R2=0.370。可以看出，前8h的预测准确性较高，中间24 h左右的预测准确性其次，最后20 h左右的预测准确性最差，这提示我们尸斑推断死亡时间在前期的血流动力学方面比较一致，而随着时间的发展，逐渐进入尸斑“固定”期，尸斑发展的血流动力学模型就比较难以预测，利用尸斑推断死亡时间的准确性也在下降，其机制不明，可能与腐败引起组织及血管破环致血管内血液渗流到组织间隙，以及腐败过程中红细胞、血红蛋白等物质的变化以及吸收光谱的变化所致。尽管如此，同指压尸斑观察是否褪色的传统方法相比，本方法的准确性明显提高。因为，如果指压尸斑完全褪色，压力消除后尸斑又重新出现，只能粗略推断是死后12 h内；如果指压尸斑不完全褪色，则推断是死后12～24 h；如果指压尸斑不再褪色，所谓尸斑已“固定”，则推断是死后24 h以上［12］。

3.3 与其他死亡时间推断方法的比较近年来，学者们在死亡时间推断方面进行了新的探索和努力。WANG等［13］应用紫外⁃可见光分光光度计和衰减全反射傅里叶变换红外（attenuated total reflec⁃tion⁃Fourier transform infrared，ATR⁃FTIR）光谱技术分析大白兔在环境温度25℃、相对湿度40%的实验条件下左心室血浆吸光度和光谱学随死亡时间推移的变化，为推断死亡时间提供了新的实验依据和方法。WU等［14］应用气相色谱⁃质谱仪研究大鼠死后不同时间血液中55种代谢物的变化，并建立回归方程。IWAMOTO等［15］应用CT研究大鼠死后不同时间门静脉和肠内气体含量的变化，发现随着死亡时间的延长，门静脉内气体含量呈指数增加，肠内气体含量呈线性增加，提示测量死后尸体内气体的含量变化可以作为死亡时间推断的指标。但同本研究相比，这些方法需要的设备昂贵，检材处理操作复杂，不利于在基层检案中推广普及。

总之，本实验所研制的针对红细胞和血红蛋白吸收特征峰的便携式尸斑测量仪，更好地抓住了尸斑的本质，综合运用尸斑最浓部位和侧面甚至高位等尸斑不明显或缺乏部位的吸光度检测可大大提高死亡时间推断的准确性，为尸斑的客观测量及死亡时间的推断提供了新的方法，由于所研制的尸斑测量仪便于携带，操作简单，尤其对由于各种原因不能实施解剖的案例仍可适用，显示出较好的应用前景。但由于本实验只是在严格的实验条件下动物实验的结果，而在法医学实践中尸体所处的环境条件和影响因素要复杂得多［13⁃17］。所以要真正应用于法医学检案，有待进一步研究死亡原因、性别、胖瘦、季节、温度、湿度等因素对尸斑形成的影响，并在法医实际案件中进行验证。