神经调节因子1对老年C57BL/6J小鼠听皮层的保护作用

杨振栋 张云美 于亚峰

苏州大学附属第一医院耳鼻咽喉科（江苏苏州 215006）

衰老是人类不可避免的自然现象。随着年龄的增长，各个器官都会经历退变的过程。年龄相关性听力下降又称老年性聋，它的病因相当复杂，不仅与年龄相关，而且与遗传、环境、社会等因素密切相关，是个多因素疾病。毛细胞的减少和螺旋神经元的退变被认为是周围听觉系统退变的主要因素［1］。近年来，中枢听觉系统的退变也被认为伴随着周围听觉系统退变从而参与了老年性聋的病理过程［2］，导致其噪声环境下言语理解能力及处理能力的下降。听皮层作为听觉中枢的高层，随着年龄的增长同样也出现了退变［3］。如何延缓老年性聋一直是个难题，听觉中枢神经元的再生还遥不可及。

神经调节因子（neuregulins，NRGs）作为信号蛋白，介导神经系统、心脏、乳腺和其他器官系统细胞和细胞之间的联系。NRG1是其中一种，属于表皮生长因子家族成员。有研究表明NRG1⁃ErbB信号通路在内耳的发育和成长过程中起着显著的作用，NRG1能够促进I型螺旋神经元的存活［4］。那么，NRG1对听皮层神经元有无保护作用?本课题组选取老年C57BL/6J小鼠作为观察对象，研究NRG1对其听皮层是否有保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料取6～8周、42～44周的雄性小鼠分为两组，每组10只，颈椎脱臼处死后，迅速取出双侧听皮层并放置于液氮中，采用RTPCR的方法检测了两组听皮层NRG1的表达情况。取30只42～44周C57BL/6J雄性小鼠，按使用药物的不同分为NRG1组、m⁃NGF组和生理盐水组，分别给予NRG1 0.1 mg/mL，鼠神经营养因子（mouse neurotrophic factor，m⁃NGF）9 μg/mL以及生理盐水，每组10只，采用腹腔注射的方法连续给药8周，注射剂量均为0.1 mL/d。动物经颈椎脱臼处死后，迅速取出听皮层并放置于2%的戊二醛中固定，行透射电镜观察听皮层神经元等超微结构。另取标本放置于4%的多聚甲醛中固定，行免疫组化观察NRG1的表达变化。NRG1购自于美国的R&D systems。m⁃NGF购自于厦门北大之路生物工程有限公司。实验动物购自于苏州大学实验动物中心，耳廓反射均可以引出。

1.2 方法

1.2.1 实时荧光定量RTPCR检测RNA的提取按Trizol法（Invitrogen，美国）进行，确定RNA浓度后进行逆转录合成cDNA。反应体系：5×Prime⁃Script Buffer 4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL、oligo（dT）1 μL、Random 6 mers 1 μL、Total RNA 13 μL，总体系20 μL。反应条件：37 ℃，1 h；85℃，5 min。将制备好的cDNA和定量梯度阳性标准模板进行PCR扩增，扩增体系如下：2×Super⁃Real PreMix Plus 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 8 μL，总体系20 μL。PCR扩增条件：首先50℃作用3 min，接着95℃作用15 min，95℃作用10 s，55 ℃作用20 s，72 ℃ 作用30 s，接着40个循环95℃变性10 s。溶解曲线：从70℃到95℃，每增加0.5℃作用5 s。各引物序列为AC⁃TIN：上游 5′⁃GTGACGTTGACATCCGTAAAGA⁃3′，下游 5′⁃GCCGGACTCATCGTACTCC⁃3′；NRG1：上游 5′⁃TTCCCATTCTGGCTTGTCTAGT⁃3′，下游 5′⁃CCAGGGTCAAGGTGGGTAG⁃3′。

1.2.2 透射电镜取出的听皮层组织块切1 mm3的大小。在2%戊二醛4℃下固定2 h，PBS缓冲液漂洗后1%锇酸4℃下固定2 h，PBS缓冲液漂洗。梯度乙醇逐级脱水。环氧丙烷置换。环氧树脂618包埋液与环氧丙烷（1∶1）浸透2 h，环氧树脂618包埋液与环氧丙烷（2∶1）过夜，纯环氧树脂618包埋液浸透37℃6 h。包埋，切片。枸椽酸铅电子染色。透射电镜下观察。

1.2.3 免疫组化取出的听皮层组织浸入4%的多聚甲醛固定液中过夜。固定好的组织行石蜡包埋并切片，切片厚度4 μm。石蜡切片常规脱蜡和水化，用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min。切片在37℃下浸入1%BSA溶液（含0.3%triton⁃x⁃100）中封闭30 min。随后入一抗：（NRG1 1∶100）。阴性对照组采用PBS缓冲液代替一抗。置4℃冰箱中过夜，隔1 d用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min后再入相关生物素化的二抗30 min（1∶200），用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min，然后浸入ABC溶液2 h，再用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min。接着使用DAB显色15 min后镜下观察中止反应，复染使用苏木精。0.01 mmol/L PBS清洗终止反应后，用中性树胶封片后即可于镜下观察。

1.3统计学方法所有数据以均数±标准差表示，使用SPSS 19.0软件对数据采用正态分布检验、方差齐性检验，组间的均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，所有统计资料以P＜0.05来表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实时荧光定量RTPCR结果以ACTIN的表达量作为参照标准来计算两组听皮层上的NRG1 mRNA的 ΔCt以及 ΔΔCt，最后通过计算公式2⁃ΔΔCT来分别计算各基因的相对表达水平。结果显示NRG1在42～44周C57BL/6J小鼠听皮层上的表达（0.203 0±0.008 6）明显少于6～8周（0.533 3±0.313 0），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 透射电镜观察结果生理盐水组脱髓鞘改变明显（图1A）。NRG1髓鞘扭曲情况较生理盐水组改善（图1B）。m⁃NGF组髓鞘较NRG1组有轻度脱髓鞘改变（图1C）。

2.3 免疫组化结果听皮层上免疫反应产物阳性物质为棕黄色颗粒，其表达量使用IPP 6.0软件所测得的平均光密度来表示（表1）。NRG1组NRG1的表达高于其他两组（图2A），而m⁃NGF组NRG1的表达（图2B）高于生理盐水组（图2C）。

图1 使用神经调节因子后42～44周小鼠听皮层超微结构的透射电镜观察结果Fig.1 Ultrastructure of the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice after treatment observed by transmission electron microscopy

表1 3组NRG1在42～44周C57BL/6J小鼠听皮层上的表达Tab.1 Expression of NRG1 in the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice

3 讨论

临床上老年性聋分为中枢性、周围性和混合性3种，以混合性居多，即老年性聋患者同时有外周听力障碍及中枢听觉处理障碍。一般来说老年性聋分为4类，即感音性、神经性、代谢性和机械性耳聋。后来又补充了中枢型老年性聋，即听觉各级中枢呈现退行性变，这是导致老年人言语交往障碍的主要原因。这种现象又被称作中枢听觉功能障碍。

图2 使用神经调节因子后42～44周小鼠听皮层NRG1的表达变化Fig.2 Expression of NRG1 in the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice after treatment assessed with immunohistochemistry

NRG1主要表达在中枢的突触区域，与突触的传递密切相关［5］。广泛的研究已经表明NRG1通过正向和负向信号通路在突触传递中起了关键的作用［6］。NRG1的正向信号通路通过把细胞外的区域与ErbB受体结合，能够调节突触相关蛋白例如神经递质和离子通道的表达［7］。NRG1负向信号通路通过细胞质区域的核易位能上调凋亡和突触基因的表达［8］。

NRG1的中枢神经保护作用已经被国内外文献多次报道，比如在帕金森病，NRG1能够保护受损的多巴胺能神经元，能减少神经元的凋亡［9］。那么NRG1对老年鼠听觉系统的神经元和突触有无保护作用呢？有报道［10］NRG1在耳蜗和螺旋神经元上皆有显著的表达。近来有实验指出转有NRG1基因的小鼠听力较好，原因是由于NRG1使毛细胞和螺旋神经元间的突触传递得到了增强［11］。

NRG1能否用于保护听觉中枢尤其是听皮层？笔者首先采用实时荧光定量RTPCR观察NRG1在C57BL/6J小鼠听皮层上的表达，结果发现随着年龄增长有下降趋势。这表明老年小鼠听皮层退变影响了突触的传递，进而影响了听皮层的功能。XU等［12］报道NRG1作为神经保护因子，能够保护小鼠小脑神经元免受氧化应激和神经炎症，表明在与神经退行性疾病有关的神经炎症有潜在治疗应用。为了了解NRG1的保护作用，实验中使用了两种神经保护因子，一种是NRG1，一种是临床上已经普遍使用的m⁃NGF，而生理盐水作为对照。神经生长因子在体外实验中被证明能够促进小鼠耳蜗神经干细胞增殖和分化，其在治疗神经元听力损失中起到了保护作用［13］。脑源性神经营养因子在体外研究中也证明对耳蜗有保护作用［14］。m⁃NGF作为常见的外源性神经生长因子已被广泛地认为能够促进神经元存活和生长的能力。m⁃NGF能够作用于螺旋神经元及外毛细胞进而保护听力［15］。WANG等［16］研究认为m⁃NGF可作为DBA/2J小鼠的保护剂用于早期干预小鼠的进行性听力损失。NRG1的结果如何呢？免疫组化提示使用NRG1和m⁃NGF以后老年小鼠的听皮层神经元上的NRG1表达明显增高，尤其是NRG1。而通过电镜来观察听皮层的超微结构，结果发现生理盐水组听皮层脱髓鞘改变很明显。m⁃NGF组脱髓鞘好转，而NRG1组神髓鞘扭曲情况明显好转。这些结果表明神经营养因子特别是NRG1对于老年小鼠的听皮层还是有一定的保护作用。

虽然NRG1对于周围听觉系统以及中枢听觉系统均显示出一定的保护作用。然而老年性聋是个多因素疾病，NRG1能否应用于临床，疗效如何都面临着不小的挑战。对于NRG1的具体机制还需要进一步的研究。