囊胚质量对冻融胚胎移植临床结局的影响及囊胚移植选择策略

李明颖 马艳萍 高梦莹 邓波 邓莲 相立峰 李永刚

云南省第一人民医院生殖医学科（昆明650032）

多胎妊娠会带来妊娠期高血压、早产、剖宫产等多种风险，同时也会导致新生儿疾病，如早产和低出生体质量。为了提高妊娠率，多胎移植曾被普遍用于人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）。如今随着技术发展，获得单独健康的婴儿成为ART的主要目的［1］。降低多胎妊娠最有效的方法是减少移植胚胎数。如何在合理的临床结果和低多胎妊娠率之间保持平衡，是如今胚胎学家面临的巨大挑战。相比于卵裂期胚胎移植，囊胚移植可获得更高的临床妊娠率［2］。对于有卵巢过度刺激综合征（ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS）的患者来说，囊胚培养和移植也是较好的解决方案［3］。囊胚冻融移植中，胚胎发育过程和内膜分化更加同步，可以更灵活地选择移植的时机，以获得更好的临床结局［4］。同样的，单囊胚冻融移植可以获得同新鲜移植相当的活产率［5］。在＞40岁的患者中，进行选择性单囊胚移植可以获得同双囊胚移植相当的活产率，同时显著降低多胎风险［6］。

笔者研究发现，低质量囊胚对冻融胚胎临床结局有负面影响，单个优质囊胚移植可以在获得最优临床结局同最低多胎率之间，达到较好的平衡。现报告如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象本研究为回顾性分析：从2010年1月至2012年12月，共有3 419例患者，4 794周期在本中心行胚胎冻融移植（其中卵裂期移植2 740周期；囊胚期移植2 054周期）。在卵裂期冻融移植中，有487周期移植1个胚胎，2 253周期移植2个胚胎，其中有621周期为第2天胚胎移植，2 105周期为第3天胚胎移植，14周期为第4天胚胎移植；在囊胚移植中，有971周期为单囊胚移植（包含780周期单个优质囊胚移植），1 083周期为双囊胚移植周期。患者未在年龄、不孕原因、促排方案以及授精方案上进行选择。患者根据移植囊胚的数目和质量共分成以下两个对比组：（1）单优质囊胚移植组（single blastocyst transfer of high⁃quality，SBT⁃H）、卵裂期移植组（cleavage⁃embryo transfer，CT）和双卵裂期移植组（double cleavage⁃embryo transfer，DCT）；（2）单优质囊胚移植组（SBT⁃H）和双囊胚移植组（double blastocyst transfer，DBT）；（3）双囊胚移植组（DBT）根据囊胚的数目和质量分组，详细分组见结果2.3。各组间在不孕原因、新鲜周期促排方案、授精方案、冻融周期内膜准备上差异无统计学意义。

1.2 胚胎冷冻和解冻胚胎使用玻璃化冷冻试剂盒（Code.VT 102，KITAZATO BioPharma Co.Ltd.）冷冻。囊胚根据Gardner囊胚评分系统评分，选择评分在4BB及以上的优质囊胚冷冻。若患者无优质囊胚形成，则选择低质量囊胚冷冻。胚胎使用玻璃化解冻试剂盒（Code.VT 101，KITAZATO BioPharma Co.Ltd.）解冻，解冻时间为移植日上午，解冻后常规行激光辅助孵化。

1.3 内膜准备自然周期：如果患者有规律的月经周期，则行自然周期方案。阴道超声监测卵泡直径及内膜厚度，根据优势卵泡确定排卵日，5 d后行解冻胚胎移植。替代周期：如果患者月经周期不规律，则行替代周期方案。在月经周期第3天使用 Progynova®（Bayer Schering Pharma，Germany）开始内膜准备，2 mg，2次/d。第14天阴道超声测量内膜厚度，并根据结果调整Progynova®用量。内膜厚度达到8 mm后，40 mg/d肌注孕酮，5 d后行解冻胚胎移植，黄体支持持续2周。

1.4 统计学方法移植后评估指标有临床妊娠率、种植率、活产率和多胎率。移植7周后超声监测到孕囊定义为临床妊娠。使用SPSS 20.0（Armonk，NY，USA：IBM Corp.）进行统计分析：不同组之间年龄差异使用独立样本t检验分析；其余临床指标和结果（不孕原因、促排方案、授精方案、临床妊娠率、种植率、活产率、多胎率）差异使用χ2检验分析（P＜0.05认为差异有统计学意义）。

2 结果

2.1 单个优质囊胚移植和卵裂期胚胎移植结局比较本研究中共有1 227例活产婴儿出生，其中卵裂期胚胎移植组出生550例，囊胚移植组出生677例。在SBT⁃H组的临床妊娠率、种植率和活产率均显著高于CT组（P=0.000），并且多胎妊娠率显著低于CT组（P＜0.01）。即使同DCT组相比，SBT⁃H组在各项临床指标上也有极显著的优势（P＜0.01）。但是，SBT⁃H组患者年龄显著低于CT组和DCT组（表1）。

表1 SBT⁃H组和CT/DCT组比较Tab.1 Characteristics of SBT⁃H group vs.CT/DCT group

2.2 单个优质囊胚移植和双囊胚移植结局比较本研究中，囊胚移植组共有677例活产婴儿出生，双囊胚移植组（DBT）出生409例，单囊胚移植组出生268例。其中，移植单个优质囊胚（SBT⁃H）组出生231例，占全部单囊胚移植组的86.19%。在SBT⁃H组和DBT组的比较中，尽管DBT组的临床妊娠率和活产率显著高于SBT⁃H组（P＜ 0.01），但SBT⁃H组的种植率显著高于DBT组（P＜0.01），并且多胎妊娠率显著低于DBT组（P＜0.01）。两组患者间年龄差异无统计学意义（表2）。

表2 SBT⁃H组和DBT组比较Tab.2 Characteristics of SBT⁃H group vs.DBT group

2.3 囊胚质量和临床结局以SBT⁃H组做为对照组，将DBT组按照囊胚质量组合分为以下几组：（1）移植2个优质囊胚（double blastocyst trans⁃fer of 2 high⁃quality，DBT⁃2H）；（2）移植 1 个优质囊胚和1个低质囊胚（double blastocyst transfer of 1 high⁃quality，DBT⁃1H）；（3）移植 2个低质囊胚（double blastocyst transfer of 2 low⁃quality，DBT⁃2L）。DBT⁃2H组的临床妊娠率、种植率和活产率显著高于SBT⁃H组（P＜0.01），但多胎率显著高于SBT⁃H组（P＜0.01），为SBT⁃H组的23.56倍。随着移植低质囊胚数量的增加，DBT组临床妊娠率、种植率、活产率逐渐下降。虽然多胎妊娠率逐渐下降，但仍显著高于SBT⁃H组（P＜0.01）。并且随着低质囊胚数目的增多，临床妊娠率、活产率逐渐接近或者低于SBT⁃H组，且从DBT⁃1H组开始，种植率即开始显著低于SBT⁃H组（P＜0.01）。4组患者间年龄差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

表3 SBT⁃H组和不同囊胚质量分组比较Tab.3 Characteristics of SBT⁃H group vs.DBT groups of variant qualities

3 讨论

在辅助生殖技术中，伴随着多胎妊娠，会导致母亲和新生儿多种风险提高，减少移植胚胎数量是最有效的控制多胎妊娠的方法。胚胎在8细胞期后基因组激活的异常会导致种植失败，在囊胚中，非整倍体率要显著低于卵裂期胚胎。目前，卵裂期胚胎选择系统主要基于形态学参数的评估，随着技术的进步，囊胚培养可以选择更有发育潜能的胚胎进行移植，因而为不孕夫妇提供更大的机会。研究表明［7］，一些未达到冷冻标准的低质胚胎也可以形成囊胚，降低D3胚胎进行囊胚培养的选择标准，可以让更多的患者受益。本研究也表明，51.91%的低质量卵裂期胚胎可以形成囊胚（数据未给出）。相对于卵裂期胚胎移植，囊胚移植具有更大的优势。囊胚移植的妊娠率显著高于卵裂期胚胎移植，并可以降低宫外孕率［2，8］。单囊胚移植在维持较高妊娠率的同时，可以显著降低多胎妊娠率［5-6，9］。尽管一些研究［10-11］认为新鲜囊胚移植会增加单卵双胎（monozygotic twinning，MZT）的概率，但也有国内外的研究［12-13］表明，不论是新鲜移植还是冻融移植，囊胚移植并不会增加单卵双胎的发生概率。同时，考虑到其更高的妊娠率和更少的移植数目，应该鼓励患者进行囊胚移植。

笔者的结果同之前的研究结果类似，单个优质囊胚移植组的临床结局显著好于卵裂期胚胎移植组，甚至同移植2个卵裂期胚胎的患者相比，单个优质囊胚移植也有极显著的优势。根据表1结果，SBT⁃H组患者平均年龄显著高于CT组以及DCT组（分别为30.93、32.13和31.97，P＜ 0.01），笔者分析数据后发现，这种年龄差异主要是由于卵裂期移植中，35岁以上患者所占比例较多。当只统计35岁及以下患者时，3组之间患者年龄差异无统计学意义（同SBT⁃H组相比，P值分别为0.769和0.927），且SBT⁃H组的临床妊娠率、种植率、活产率仍然极显著高于CT组和DCT组（P＜0.01），多胎率极显著低于二组（P＜0.01，具体数据未给出）。结果表明，即使同移植2个卵裂期胚胎相比，单个优质囊胚移植仍然有着极大的优势。在囊胚移植组中，本研究表明，尽管双囊胚移植组临床妊娠率显著高于单个优质囊胚移植组，但其种植率显著低于单个优质囊胚移植组，并且多胎率为单个优质囊胚移植组的20多倍。值得思考的是，是否值得用如此高的多胎率来换取高的妊娠率？

在双囊胚移植的进一步分组中，随着低质量囊胚数目的增加，临床妊娠率、种植率和活产率逐渐降低，其中临床妊娠率和种植率的降低趋势更为明显。尽管多胎妊娠率也随之降低，但是相对于单个优质囊胚移植组，其多胎妊娠的结果仍然无法接受。值得注意的是，1个优质囊胚＋1个低质量囊胚的组合和移植单个优质囊胚相比，其临床妊娠率差异无显著性，但种植率显著下降。在移植2个低质囊胚组中，尽管差异无显著性，其临床妊娠率和活产率都低于单个优质囊胚移植组。

该结果表明，低质量囊胚的移植可能会对临床结局，特别是种植率产生负面影响，并且对于多胎率的降低没有显著贡献。因而，低质量囊胚的冷冻并无较大的临床意义，反而会增加患者的就诊费用。综合考虑妊娠结局和多胎妊娠给母亲和新生儿增加的风险，移植单个优质囊胚要优于移植2个囊胚，可以达到相对理想的临床结局。尽管囊胚培养会增加患者的部分就诊费用，但是考虑到其较高的单个移植周期的成功率，囊胚培养显然对患者更有益。

另外，本研究中，采用的是非选择性的囊胚培养。其中，仍有47.52%的胚胎（5.28%的患者）无法获得囊胚（数据未给出）。考虑到患者对该结果的接受度，非常有必要建立一个选择性的囊胚培养评估系统，以选择更有潜能的胚胎进行囊胚培养，使患者受益。