新生小鼠心脏再生机制的研究进展

陈秉瑞 范燚 综述 王连生,2 审校

(1.南京医科大学研究生院，江苏 南京 210000； 2.南京医科大学第一附属医院心内科，江苏 南京 210029)

1 背景

长期以来，心脏被认为是有丝分裂后的器官,心肌细胞被认为不具有分裂或再生能力。近年在斑马鱼和新生小鼠中发现了心脏再生能力，对于心脏损伤治疗的研究来说无疑是突破性的进展，对于哺乳动物甚至人类的心脏修复有着重要的提示意义。新生小鼠的心脏再生有多方面因素参与其中：DNA甲基化、miRNA(小RNA)、关键蛋白、信号通路、蛋白激酶等都在新生小鼠心脏再生中发挥重要作用。基因调节机制中，DNA的甲基化在器官发育、组织分化和细胞特化等方面发挥双向调控作用。其中，启动子区域的DNA甲基化与转录抑制存在密切联系[1]。miRNA对基因表达有着重要的影响，可以协同作用于重要细胞通路中的多种成分，影响细胞表型。多个miRNA簇在小鼠发育早期表达，维持组织特异性，参与祖细胞识别。蛋白激酶诱导蛋白质磷酸化，激活多条信号通路和多种生物过程，在生物的生长发育中有着至关重要的作用。

2 DNA甲基化参与出生后心肌细胞转录抑制

出生后1～7 d，在与新生小鼠心血管系统发育有关的基因的启动子中，存在着许多差异性甲基化区域。这些区域中的绝大多数都会在生后第7天出现DNA的甲基化增加[2]。同时，新生小鼠心脏的再生能力在生后第7天出现明显的下降，这提示，DNA的甲基化很可能抑制了心肌细胞的再生能力。研究表明，在生后7 d甲基化修饰增加的基因主要参与了心脏的发育，并且是多种转录调节因子的作用目标。例如，心脏特异性肌增强因子Mef2可以与GATA4和Tbx5协同作用，促使新生成的纤维细胞向心肌细胞样细胞转化[3]。Tead4上调Hif1α，刺激缺血后的血管发育和心脏恢复[4]，这些作用都有助于促进心脏再生。生后7 d时，Mef2和Tead4都出现大量的甲基化富集区，使其转录受到抑制，表达减少，心肌细胞增殖能力随之下降。

3 miRNA参与新生小鼠心肌细胞增殖再生

3.1 miRNA 302-267簇抑制Hippo通路

miRNA 302-267簇表达于胚胎形成早期，参与维持胚胎期心肌细胞持续、高水平的增殖活动，最终引起心脏增大，在出生后心脏中不表达。然而，通过构建过表达的小鼠模型，在出生后心脏中持续再表达该簇，该簇可以重新激活心肌细胞进入细胞周期，促进心肌细胞的增殖再生，延长心肌细胞去分化状态，抑制成熟心肌细胞表型，促进心力衰竭的发生。此外，Ying等在成年小鼠心肌梗死后通过尾静脉注射该簇，使其在心脏内聚集，观察到心肌细胞出现了去分化现象，增殖增加，凋亡减少[5]。

Hippo信号通路是经典而保守的调节器官大小和细胞增殖的信号通路，其主要成分包括上游哺乳动物不育系20样激酶(MST)、肿瘤抑制因子(LATS)与下游YAP蛋白等，抑制MST和LATS导致YAP进入细胞核激活基因表达，促进心肌细胞增殖[6]。miRNA 302-267簇通过部分地作用于Hippo信号通路的多种成分来发挥促进心肌细胞增殖的效应。研究表明，miRNA 302-267簇过表达导致MST1、LATS2的表达下降；敲除该基因簇则会使前述基因表达增加，从而增加YAP蛋白的磷酸化，维持YAP蛋白的无活性形式，减少其向胞核的转移。以上证据说明miRNA 302-267簇通过抑制这些基因来抑制Hippo通路的活性，从而发挥促进心肌细胞增殖的功能。

3.2 miRNA-204抑制核转录因子Jarid2

miRNA-204在肿瘤形成、眼的发育、糖尿病及肺动脉高压等领域被广泛研究，而在心脏领域研究甚少。miRNA-204参与调节人类心脏祖细胞的增殖和分化，可能对心肌细胞增殖再生产生影响。另有研究表明，过表达miRNA-204可以抑制核转录因子Jarid2的表达，从而上调细胞周期蛋白基因CycD1的表达，引起新生小鼠心肌细胞增殖[7]。

4 蛋白质的作用

4.1 成纤维细胞生长因子10调节心肌细胞增殖

成纤维细胞生长因子(FGF)10是成纤维细胞生长因子家族(FGFs)的成员，通过与成纤细胞生长因子受体(FGFR)相互作用，参与促进损伤修复、毛发生长、干细胞增殖分化、肿瘤及器官发育等多种生命过程。在小鼠心肌损伤后，持续过表达FGFR，可以促进新生血管形成，改善损伤区血液循环，对心功能产生保护性作用。此外，FGF10还参与心外膜上皮间质细胞的转化：作用于FGFR2b，促使心外膜上皮间质细胞转化成纤维细胞，并由此促进心脏外基质形成，有利于心肌细胞增殖[8]。新生小鼠心室切除后，心外膜细胞向损伤区发生扩展，并对治疗性FGF10处理能产生增殖反应[9]。但是，虽然FGF10在正常心脏中大量表达，在未损伤的心脏中过表达FGF10则不会影响心肌细胞的数量。这说明，FGF10能在一定程度上促进心肌细胞增殖反应，但其单独作用尚不能启动心肌细胞重新进入细胞周期。

4.2 GATA4上调FGF16表达

GATA家族成员属于锌指转录因子家族，包含一个或多个高度保守的锌指-DNA结合域，能特异性结合在含HGATAR的DNA结构域上。脊椎动物包含6种GATA因子，其中GATA4在心脏发育中发挥重要作用。GATA4参与调节多种心脏特异性功能基因，这些基因对新生心脏发育尤为重要,参与心肌细胞的分化、迁移、肥大、纤维化和存活等重要的生命过程。近来研究表明特异性敲除心肌细胞中的GATA4会导致新生心脏损伤后无法启动心肌再生程序，出现纤维疤痕修复。在进一步的研究中，利用腺相关病毒AAV9在心脏中过表达FGF16，可以部分地挽救GATA4敲除引起的表型，证明了GATA4通过直接上调FGF16表达发挥效应[10]。这说明GATA4/FGF16轴参与了新生心脏再生的调节。此外，FGF2在非心肌细胞中表达，能够促进心肌肥大、瘢痕修复[11]。FGF16可以通过竞争性结合FGFR1c来抑制FGF2的功能，从而抑制心肌肥厚和纤维化[12-13]，促进心肌损伤修复再生。

4.3 Meis1抑制新生心脏再生

Meis1属于TALE同源结构域转录因子家族，是胚胎发育期心脏分化的中心调节因子[14]，参与维持心脏的正常发育，但其在心肌细胞周期中的作用尚不清楚。研究发现，敲除Meis1会影响细胞周期活性和生后心肌细胞的胞核形成，同时又不会增加心肌细胞凋亡。另一方面，在小鼠中过表达Meis1不会降低心脏质量，但会抑制新生心脏心肌细胞的再生，同时上调周期蛋白依赖性激酶抑制因子[15]。这说明Meis1过表达会阻滞未成熟心肌细胞的细胞周期。虽然目前还不能说明Meis1 激活的具体机制，但总体来说，Meis1表达伴随3种Hox基因上调，以稳定其DNA结合能力，增强其转录活性。

4.4 松弛素上调心脏转录因子并增加细胞存活

松弛素(RLX)是一种心脏激素，由心肌细胞产生，能够与特异性心肌受体结合，在新生阶段的心脏发育中发挥促进作用。研究表明，RLX应用于新生小鼠心脏，可以上调GATA4、Nkx2-5等心脏转录因子[16]。这些转录因子在心脏成熟期间可以诱导心脏特异性的结构基因的表达，并通过发挥抗凋亡作用增加细胞存活，从而促进心肌再生。但是，RLX对心肌细胞的作用是双相的。在小鼠出生后24 h内，RLX促进心肌细胞增殖；24～48 h，RLX会降低心肌细胞增殖的速率；而在出生48 h后，RLX就无法影响心肌细胞增殖[17]。

5 利用蛋白激酶治疗心脏损伤的尝试

5.1 神经调节蛋白1与ERBB家族的协同作用

神经调节蛋白1(NRG1)及其酪氨酸激酶受体ERBB4、ERBB3和ERBB2在心脏发育中发挥重要作用[18-20]。其中ERBB2主要在胚胎、生后和新生心脏中表达，并促进心肌细胞增殖[18]。ERBB2并不与配体结合，但对其他ERBB受体与配体的结合具有稳定作用，从而增强配体诱导的受体信号。在心肌中，ERBB2主要与ERBB4协同作用。Ganapathy等[21]在小鼠出生后的一个月内，每天给予小鼠皮下注射rNRG1 100 ng/g，发现NRG1与ERBB2结合后， 会上调细胞外调节蛋白激酶和蛋白激酶B，下调GSK3β，从而调节心肌细胞的肥大、去分化和增殖。其中，细胞外调节蛋白激酶上调会抑制心肌细胞去分化，减少肥大反应；蛋白激酶B上调则会增强心肌细胞去分化，减少肥大反应；GSK3β下调增加β连环蛋白聚集和RUNX1表达，促进依赖β连环蛋白的细胞周期活性。ERBB2对GSK3β的抑制作用可以使心肌细胞在7 d龄后仍然保持稳定的去分化和增殖能力，从而延长出生后心脏再生时间窗。这些都有助于促进心脏再生，同时不会引起其他脏器的生长。

5.2 D492上调自噬促进损伤修复

自噬过程参与细胞生长、分化和细胞物质的平衡，腺苷酸依赖的蛋白激酶(AMPK)通路和mTOR通路是调节细胞自噬的重要信号通路。AMPK通路可以通过促进UlK1的磷酸化直接调节自噬，或者抑制mTOR通路来间接调控，mTOR通路则通过抑制UlK1负性调节自噬[22-23]。D492是AMPK选择性激动剂，已被证明可在人类前列腺肿瘤PC3细胞中引起自噬。Yang等在新生小鼠原代心肌细胞中诱导氧糖剥夺和复氧OGD/R，并用成年小鼠构建了心肌缺血再灌注损伤模型[24]。给予心肌细胞D492处理后，D492显著地上调AMPKα磷酸化，下调p70S6和4EBP1的磷酸化，从而激活AMPK通路，抑制mTOR通路，引起细胞自噬，减少OGD/R导致的心肌细胞凋亡，从而发挥了保护性作用。在成年小鼠的缺血再灌注损伤模型中，D492也通过同样的途径，减少心肌细胞受到的缺血性损伤。

6 结论与展望

近年来的研究表明，低等脊椎动物和部分新生的哺乳动物的心脏及其他内脏损伤后可以完全再生。成人的心肌细胞可以较低的速率再生，但这种低度的再生并不能修复心脏的缺血性损伤。心脏在发育过程中关闭自身再生的能力，从进化的角度而言，其优势尚不为人所知。心脏再生治疗已发展出多种手段，包括细胞替代疗法、内源性祖细胞群激活、心肌细胞的细胞周期重启和细胞系直接重编程；但是由于成年患者的内源性生理限制和翻译屏障，这些治疗方法的效果都不够理想。目前的研究表明，蛋白激酶能够增强内源性再生能力，促进新生和成年小鼠的心脏损伤修复，向临床转化的前景尤为可观，值得继续深入地研究。