α-酮戊二酸对慢性氨氮胁迫下草鱼肾Rh糖蛋白、热休克蛋白70和过氧化物酶增殖物激活受体γmRNA表达的影响

付 莹， 皮 杰，赵玉蓉，王红权

（1.湖南农业大学湖南畜禽安全生产协同创新中心，湖南长沙 410128；2.湖南应用技术学院，湖南常德 415000；3.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南常德 415000）

在当前的集约化养殖模式和日益严重的环境污染下，水体常常出现氨氮大量积累。大多数硬骨鱼类对氨氮毒性非常敏感，水体中高浓度氨会导致鱼血液中氨氮含量升高，影响鱼类的呼吸系统、中枢神经系统和免疫系统，从而抑制鱼类生长、降低鱼体免疫力、阻碍鱼体能量代谢和离子平衡（Qian 等 ，2016；Schram 等 ，2014；Braissant 等 ，2013；强俊等，2011）。因此，寻找一种能有效缓解氨氮毒性的营养添加剂迫在眉睫。α-酮戊二酸（α-KG）是三羧酸循环中重要的代谢中间产物，同时也是连接机体内碳-氮代谢的关键节点。大量研究表明，α-KG能够调节机体氮代谢 （魏玉强，2015），促进动物体内的蛋白质合成 （Yao等，2012；王蕾等，2010），提高动物生长性能（余亲平等，2010；胡泉舟，2008）；缓解动物在应激状态下的能量代谢障碍（Li等，2010；刘坚等，2009），为机体供能；并维持动物肠道健康（胡泉舟等，2008；Kristensen等，2002），提高机体免疫力（宋方杰等，2016；王连生等，2016）。

Rh糖蛋白（Rhesus glycoproteins）是一类广泛存在于真细菌、原生生物和动物体内的蛋白。大量研究表明，Rh糖蛋白在鱼类氨转运的过程中有着重要的作用，能介导氨的转运和排泄 （Sinha等，2013；Nakada等，2007； Hung等，2007）。热休克蛋白（HSP）是细胞受到各种刺激后诱导产生的一组应激蛋白，对细胞损伤具有保护作用。研究发现，HSP70在细胞内蛋白质转运、提高细胞对应激原的耐受性和促进免疫反应等方面 （杨震国，2010；Srivastava 等，2002；Jacquiersarlin 等，1994；Welch等，1991）具有重要作用。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是一类能调节目标基因表达的核内受体转录因子 （刘美莲，2001），在心血管保护、炎症形成的抑制、免疫的调节、胰岛素抵抗的治疗和细胞分化的调节中起关键作用（Vosper等，2002；Berger等，2002）。

研究表明，日粮中添加α-KG能够显著影响HSP70和PPARγmRNA在草鱼鳃、肾、脾脏和肝脏中的表达（梁健等，2014b）；并且在急性氨氮胁迫的条件下，日粮α-KG能够显著影响草鱼体内Rhag和Rhcg2的表达，对草鱼的急性氨氮胁迫有一定缓解作用（梁健，2014a），但对草鱼慢性氨氮胁迫的相关研究还鲜见报道。本试验拟探究饲料中添加α-KG对慢性氨氮胁迫下草鱼（Ctenopharyngodonidellus） 肾 中 Rhag、Rhcg1、Rhcg2、HSP70和PPARγmRNA在不同时间点的表达及其规律，以期为草鱼的健康养殖和绿色环保饲料开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲粮 根据草鱼配合饲粮标准（SCT 1024-2002）配制基础饲粮，配方及营养成分见表1。研究表明，草鱼饲粮中α-KG的最宜添加量为7.5 g/kg（Wang 等，2016；梁健 2014a）。 因此，本试验以7.5 g/kgα-KG等量替代基础饲粮中次粉，配制α-KG饲粮。用逐级扩大法将饲料原料均匀混合，制成直径2 mm的颗粒料，自然风干后置于-20℃保存备用。α-KG购自湖北远成集团，纯度99.8%。

1.2 试验动物及分组 试验用草鱼购自湘阴巨丰渔业有限公司，饲养于容积为250 L的塑料桶。选取体格相近的健康草鱼270尾 [初始体重为（24.79±0.11）g]，随机分成 3个处理组，分别为 C组 （对照组，养于曝气后自来水中并饲喂基础饲粮）；T1组（氨氮组，养于氨氮浓度为18.37 mg/L的水中并饲喂基础饲粮）和T2组（α-KG组，养于氨氮浓度为18.37 mg/L的水中并饲喂0.75%α-KG饲粮），每个处理组设3个重复桶，每个重复桶放养30尾鱼。

表1 基础饲粮组成及营养水平

1.3 饲养管理 草鱼氨氮安全浓度为3.06 mg/L（梁健，2014a），T1和T2处理所设氨氮浓度为安全浓度的6倍，即18.36 mg/L，通过10 g/L的氯化铵母液调制。养殖试验在湖南农业大学水族基地进行，所有试验用鱼提前适应试验环境和饲料。正式试验期间，每天上午9：00和下午17：00投喂饲粮，进食完成后吸出残饵和粪便，然后换水（约1/3体积），添加氯化铵母液、氢氧化钠溶液或盐酸溶液以维持试验所需要的氨氮浓度和pH。每天定期监测水体氨氮浓度、温度和pH，养殖桶24 h连续充氧。试验期间各组的氨氮含量实测值分别为：C 组 （1.51±0.083）、T1组（18.71±0.617） 和T2组 （18.26±0.398）， 水温为（27.25 ± 2.51）℃，pH 为（6.55 ± 0.29）。

1.4 样品采集 采样时间分别为第1、7、42天。每次采样时，每桶随机选取体重接近的4尾鱼，经MS222麻醉后用2.5 mL无菌注射器尾静脉采血，用1 g/L的肝素钠溶液抗凝，3500 g、4℃离心10 min，取上层血浆于-40℃保存备用。将草鱼置于冰上，用灭菌的解剖工具取肾和中肠，分别用灭菌的锡箔纸包好后放液氮中速冻，-80℃保存备用。

1.5 血氨的测定 血氨的测定采用高效液相色谱-四级杆离子阱串联质谱仪进行，由北京质谱医学研究有限公司完成，血氨含量以μmol/L表示。

1.6 基因表达分析

1.6.1 引物设计及合成 参照陈亮 （2011）的方法，以β-肌动蛋白（β-actin）mRNA序列作为内参基 因 ， 根 据 NCBI 中 草 鱼 Rhag、Rhcg1、Rhcg2、HSP70和PPARγ基因序列登录号 （分别为KJ141203、KJ141202、KJ141205、GU475146 和GU997136）设计引物（表2）。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.6.2 总RNA的提取及cDNA合成 采用TaKaRaMiniBEST Universal RNA Extraction（TaKaRa，China）提取总 RNA，所有过程均在无菌操作台上严格按照操作说明书进行。使用核酸蛋白质仪检测总RNA的质量和浓度，使用1%的琼脂糖电泳检测RNA的完整性，完整性好且A260/A280值为1.8～2.0的总RNA用于cDNA合成。cDNA合成按照TaKaRaPrimeScriptTM RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa，China）操作说明书进行，反应结束后-20℃保存备用。

1.6.3 实时荧光定量PCR 实时荧光定量PCR采用SYBR GreenⅠ染料法，按照SYBR Premix EX TaqTMⅡ （TaKaRa，China） 操作说明书在CFX96荧光定量PCR仪（Bio-Rad，USA）进行定量分析。反应体系为：10 μL SYBR Premix EX TaqⅡ，2 μL稀释后的cDNA模板，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，ddH2O 6.4μL，反应程序为 95 ℃ 30 s；95 ℃5s，60℃40 s，35个循环；熔解曲线程序为从65℃升温到95℃，每5 s增加0.5℃。数据收集使用CFX manager software 3.1（Bio-Rad，USA）。

1.6.4 扩增效率的检测 将多个样品的cDNA各取1μL混匀后，进行10倍系列稀释，选取6个梯度进行实时荧光定量PCR扩增反应，每个稀释度设3个重复，根据扩增反应结果，β-actin、Rhag、Rhcg1、Rhcg2、HSP70 和 PPARγ 的扩增效率分别为 96%、100.4%、98.3%、99.7%、103%、101%，符合实时荧光定量PCR中双Ct法对扩增效率的要求（唐永凯等，2008）。

1.7 数据统计分析 用公式 2-（ΔΔCt）（唐永凯等，2008）计算各基因mRNA的相对表达量。用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析和Duncan氏多重比较，试验结果用“平均值±标准误”表示，差异显著水平为P＜0.05。

表2 所用引物序列

2 结果与分析

2.1 α-KG对氨氮胁迫下草鱼血氨含量的影响由图1可知，1 d时，氨氮胁迫及饲粮α-KG的添加均可显著影响草鱼血氨含量（P＜0.05）。其中，T1组血氨含量较对照组显著升高（P＜0.05），而T2组血氨含量显著降低（P＜0.05）。7、42 d时，三组间血氨含量均无显著差异。

2.2 α-KG对氨氮胁迫下草鱼肾Rh糖蛋白mRNA表达量的影响 由表3可知，肾RhagmRNA表达量在氨氮胁迫后第1天和42天三组间存在显著差异。第1天时，氨氮胁迫下草鱼肾RhagmRNA的表达显著上调 （P＜0.05），而T2组肾RhagmRNA表达量与C和T1组相比均无显著差异。第42天时，与对照组相比，氨氮胁迫显著上调草鱼肾中Rhag mRNA的表达，而α-KG的添加使T2组草鱼肾中Rhag mRNA表达量较T1组显著增加。此外，氨氮胁迫后7 d，T1组与对照组肾Rhcg1 mRNA表达量无显著差异，α-KG的添加显著下调肾Rhcg1 mRNA表达（P＜0.05）。第42天时，氨氮胁迫使肾Rhcg1 mRNA表达量显著上调，而α-KG的添加对氨氮胁迫下肾Rhcg1 mRNA表达量无显著影响。三组间肾Rhcg2 mRNA表达量在氨氮胁迫第1、7和42天均无显著差异。

图1 α-KG对氨氮胁迫下草鱼血氨含量的影响

2.3 α-KG对氨氮胁迫下草鱼肾HSP70和PPARγ mRNA表达量的影响 由表4可知，草鱼肾中PPARγmRNA表达量在第1、7和42天三组间均无显著差异，HSP70 mRNA表达量在第1和7天时三组间存在显著差异（P＜0.05）。第1天时，与对照组相比，氨氮胁迫草鱼肾中HSP70 mRNA表达量无显著影响，而α-KG的添加使T2组草鱼肾中HSP70 mRNA表达较T1组显著上调（P＜0.05）。第7天时，T1组草鱼肾中HSP70 mRNA表达量较对照组显著下降（P＜0.05），T2组草鱼肾中HSP70 mRNA表达较T1组无显著差异。

3 讨论

3.1 α-KG对氨氮胁迫下草鱼肾Rh糖蛋白mRNA表达量的影响 大量研究表明，Rh糖蛋白能作为水生动物的氨转运载体，介导和促进NH3的转运及排泄（Braun 等，2009；Weihrauch 等，2009；Nakada等，2007），对水生动物的氨转运起着重要作用。本试验中，氨氮胁迫后1d，T1组草鱼肾RhagmRNA表达量显著提高，而α-KG的添加能够缓解RhagmRNA表达量显著提高。这可能说明氨氮胁迫后1d，草鱼血氨含量显著升高，机体通过提高RhagmRNA表达量的途径来增加体内氨的转运，有利于鱼体应对氨氮胁迫。而α-KG的添加使T2组血氨含量较T1组显著降低，机体内氨氮毒性减小，从而草鱼肾中Rhag mRNA表达量降低，这与梁健等（2014b）的结论一致。氨氮胁迫7 d后，T1组Rhcg1 mRNA表达量与对照组无显著差异，但T2组Rhcg1 mRNA的表达量较T1组显著降低。这可能是因为氨氮胁迫7 d后，草鱼体内血氨含量下降，体内氨氮毒性降低，因而T1组Rhcg1mRNA的表达量与对照组无差异，鱼体对氨的转运有所降低。而T2组Rhcg1mRNA表达量的显著降低，这可能是肾脏是动物体代谢产生氨的器官（郭珲，2008），而α-KG的添加能降低肾脏内氨的产生，以应对氨氮毒性，因而Rhcg1对内源性氨的转运降低。在长期氨氮胁迫的相关研究中，许多研究均表明长期氨氮胁迫会对水生生物的生长、氨基酸代谢、鳃组织的形态以及免疫应答等 （黎庆等，2015；Schram等，2010；Pinto 等，2007；Foss等，2004） 造成负面影响。本试验中，氨氮胁迫42d后，T1组和T2组Rhag和Rhcg1 mRNA的表达量均显著升高。这可能表明草鱼在长期氨氮毒性的影响下，机体需要提高氨的转运，以应对可能造成的负面影响。

3.2 α-KG对氨氮胁迫下草鱼肾HSP70和PPARγmRNA表达量的影响 HSP70作为HSP家族中最主要的一类，在保护细胞免受损伤、增强机体对应激原的耐受性、促进机体免疫反应等（Srivastava等，2002；Jacquiersarlin 等，1994；Welch 等，1991）多个方面具有重要作用。Nakano等（2002）研究发现，当潮间带杜父鱼体内HSP70含量及mRNA表达量较高时，机体的抗应激能力更强。本试验中，氨氮胁迫1 d后，T1组草鱼肾中HSP70 mRNA表达量无显著变化，而α-KG能够显著上调HSP70 mRNA的表达。这可能说明草鱼对氨氮胁迫的调节能力有限，而外源α-KG能够通过上调草鱼氨氮胁迫下HSP70 mRNA的表达，提高应激耐受力和免疫力，从而保护鱼体。氨氮胁迫7 d后，T1组和T2组HSP70 mRNA表达量较对照组显著降低。这可能是因为氨氮胁迫7 d后，草鱼已经出现一定程度的适应，从而HSP70 mRNA的表达下调。氨氮胁迫42 d后，T1组和T2组HSP70 mRNA的表达量与对照组相比无显著差异，这可能是鱼体应对长期氨氮毒性的一种适应性调节。

表3 饲料中添加α-KG对氨氮胁迫下草鱼肾Rh糖蛋白mRNA表达量的影响

表4 饲料中添加α-KG对氨氮胁迫下草鱼肾HSP70和PPARγmRNA表达量的影响

4 结论

氨氮胁迫下，饲粮α-KG的添加能够有效缓解草鱼前期血氨含量的升高，并调节氨氮胁迫下Rhag、Rhcg1和HSP70的mRNA表达量，有利于草鱼应对慢性氨氮胁迫。