围产期奶牛低血糖症血液生化指标的诊断评价

张广和， 李国鹏， 李心慰， 韩天龙,3， 刘国文

（1.吉林大学动物医学学院，吉林长春130062；2.内蒙古赤峰市国营农牧场综合服务站，内蒙古赤峰 024000；3.赤峰市农牧科学研究院，内蒙古赤峰 024031）

奶牛围产期是指妊娠奶牛分娩前和分娩后的一段时期，一般指产前3周和产后3周共6～8周的时期，国外多称之为过渡期。围产期奶牛由于经历妊娠、分娩和泌乳三个阶段的生理应激，体内代谢发生剧烈变化，尤其是干物质摄入不足导致的能量负平衡，使围产期奶牛健康和繁殖生产遭受严重威胁。葡萄糖是反刍动物能量的主要来源，参与机体多种生理代谢过程，也是泌乳合成乳糖的重要物质来源。反刍动物葡萄糖合成主要由内源性生成和外源性吸收获得，其中以内源性生成为主（妖军虎，2013）。日粮提供的碳水化合物在瘤胃微生物作用下生成丙酸被瘤胃壁吸收转至肝脏经过一系列酶促反应最终进入血液供机体利用。所以血液中葡萄糖浓度变化对于了解机体能量变化情况是最直接的参考依据。奶牛低血糖症是由众多因素引起血糖浓度降到正常值外的一种临床常见综合征，低血糖主要由中枢神经系统、内分泌腺、肝脏、胃肠、营养和运动调节。它是糖代谢紊乱的一个反应指标而不是疾病诊断的本质。本研究对围产期奶牛低血糖发病率进行调查，目的是了解围产期能量负平衡的严重程度以及发生疾病的预警，对于预测围产期奶牛群体性能量负平衡提供参考；血液生化指标的监测从能量、肝功能以及矿物质代谢方面了解围产期奶牛低血糖症发生的代谢情况，为早期疾病预防带来参考。

1 材料和方法

1.1 试验动物 本试验选取吉林省长春市某奶牛场围产期荷斯坦奶牛171头，通过临床症状、胎次、产奶量、体况评分（BCS）、干物质摄入量（DMI）和血液相关指标等，最终筛选出53头奶牛为本试验低血糖组奶牛。低血糖症奶牛的判定标准是GLU＜2.5 mmol/L。选取53头健康奶牛作为对照组。在发病率调查中，以周为时间单位，选取7个时间点，每个时间点不少于17头奶牛。试验组和对照组所有奶牛日粮均按NRC标准配制，采用舍饲，自由采食。

1.2 循环血液样本的采集 根据场内管理系统记录，计算奶牛预产期，选择产前3周（-21 d）、2 周（-14 d）、1 周（-7 d）、分娩当天（0 d）和产后1周（7 d）、2 周（14 d）、3 周（21 d）7 个时间点的围产期奶牛和健康奶牛，每头奶牛血液样品的采集均于清晨投饲前颈静脉无菌采集20 mL。10 mL血液肝素钠抗凝处理用做分离血浆，另10 mL血液不添加抗凝剂用做分离血清。分别于3800 g离心10 min，收集血浆（或血清）于事先准备好的无菌冻存管中，准确标记后，-80℃保存待测。

1.3 测定指标和方法 测定指标具体为：葡萄糖（GLU）、β-羟丁酸 （BHBA）、 非酯化脂肪酸（NEFA）、甘油三酯（TG） 、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（GGT）、乳酸脱氢酶（LDH）、钙（Ca）、镁（Mg）和磷（P）。 采用常规生化试剂盒于吉林大学第四医院医学检验科测定，具体操作步骤按试剂盒使用说明书进行。具体检测方法见表1。

表1 血液生化指标检测方法

1.4 数据统计与分析 数据采用SPSS 19.0进行分析，组间差异显著性采用one-way ANOVA进行分析，测定指标与NEFA、BHBA的相关性采用Bivariate Correlations皮尔逊检验分析，结果用“平均值±标准差”表示。

利用SPSS 19.0-ROC-Curve程序建立ROC曲线，比较各指标曲线下面积（Auc），并导出各指标分析结果中的敏感度和1-特异度值至Excel，利用公式：约登指数（Youden）＝敏感度-（1-特异度），计算YI最大值，其对应的检测值即为cutpoint，其中Se表示正确判断病牛的比率，Sp表示正确判定非病牛的比率，Se越高表明漏诊几率越小，Sp越高表明误诊概率越小。本研究以Se大于等于0.70作为具有诊断意义的可能下限。Auc＞0.5时，其值越大表明该指标的诊断准确性越高；Auc＜0.5时，则表明该指标无实际诊断价值。

2 结果

2.1 围产期奶牛低血糖症发病率调查 如图1所示，从产前21 d奶牛低血糖发病率逐渐增加，分娩当天达到发病高峰（81.5%），产后逐渐降低，但至产后3周仍保持40%的发病率。

图1 围产期奶牛低血糖症发病率调查

2.2 围产期低血糖症奶牛血液生化指标的改变及其与NEFA、BHBA相关性分析 从表2可知，与健康奶牛相比围产期低血糖奶牛NEFA、BHBA、AST显著升高 （P＜0.05或0.01），GLU和Ca显著降低（P＜0.05或0.01），其他指标改变不大（P ＞ 0.05）。围产期低血糖奶牛 GLU（r＝-0.597，P＝0.005）、Ca（r＝-0.490，v＝0.028）与 NEFA 呈显著负相关，BHBA（r＝0.632，P＝0.003）与 NEFA 呈显著正 相 关，GLU （r＝-0.629，P＝0.004）、NEFA （r＝-0.632，P＝0.003）与 BHBA 呈显著负相关， AST（r＝0.704，P＝0.001）与 BHBA 呈显著正相关。

2.3 高相关性血液生化指标在奶牛低血糖症诊断中的效用评价及参数确定 如图2，表3所示，利用ROC曲线分析，在奶牛低血糖症诊断中高相关性血液生化指标的Auc分别为NEFA（0.721）、BHBA （0.674）、TG （0.621）、TBIL （0.351）、DBIL（0.459）、IBIL （0.319）、AST （0.522）、LDH （0.440）、Ca（0.018），其中 NEFA、BHBA、TG、AST 的 Auc面积大于0.5，具有诊断价值，利用Youden指数计算 cut-point 值 分 别 为 ：NEFA （Se∶0.642;1-Sp∶0.100）0.44mmol/L；BHBA （Se∶0.868;1-Sp∶0.500）0.34mmol/L；TG（Se∶0.472;1-Sp∶0.200）0.19mmol/L；AST（Se∶1.0;1-Sp∶1.0）53.00 IU/L。

表2 低血糖症奶牛血液生化指标与NEFA、BHBA的相关性分析（n=53）

图2 部分血液指标对奶牛低血糖症诊断的ROC曲线比较

表3 部分血液指标在奶牛低血糖症诊断中的灵敏度、1-特异度和临界点

3 讨论

对围产期低血糖奶牛发病率做了调查，显示产前3周至分娩当天发生率呈上升趋势，分娩当天发生率最高，为81.5%，产后发生率逐渐降低至40%，仍保持较高发生率。说明奶牛在围产期存在能量负平衡，与采食量下降，干物质摄入较少，能量来源不足致使葡萄糖（GLU）浓度下降有关。夏成等（2006）应用半定量RT-PCR方法测定了围产期奶牛PEPCK-C mRNA的丰度，发现产前奶牛低血糖的发生与肝PEPEK-C mRNA丰度低有关，胰岛素可抑制PEPCK-C转录启动子，降低PEPCK-C基因的表达，减少肝糖异生。

围产期低血糖奶牛与健康奶牛相比，NEFA差异显著，表明低血糖组奶牛存在脂肪动员，使血液NEFA浓度升高。围产期低血糖奶牛GLU（r＝-0.597，P＝0.005）、Ca （r＝-0.490，P＝0.028）与NEFA呈显著负相关，表明在围产期能量负平衡易发生低血糖及低钙血症。围产期低血糖奶牛BHBA（r=0.632，P=0.003）升高，且与 NEFA 呈显著正相关，进一步说明低血糖奶牛发生能量负平衡。围产期低血糖奶牛GLU（r=-0.629，P=0.004）、NEFA（r=-0.632，P=0.003）与 BHBA 呈显著负相关，AST（r=0.704，P=0.001）与 BHBA 呈显著正相关，表明高BHBA与肝损伤有关。利用ROC曲线分析，在奶牛低血糖症诊断中高相关性血液生化指标筛选出具有诊断价值的指标。

研究发现，妊娠后期奶牛肝脏葡萄糖净通量为零，甚至为负数，泌乳初期肝脏葡萄糖总输出量升高至妊娠后期的2.6倍，肝脏的糖异生作用在此起了最主要作用 （Piepenbrink， 等2003；Bell，1995）。血糖在机体中的代谢主要由神经内分泌激素等调控，常见的有胰岛素、胰高血糖素、肾上腺素、糖皮质激素、生长激素等（Bell，1995）。 当血糖浓度下降，胰高血糖素分泌增加，胰岛素分泌减少，肾上腺素增加，机体对糖的吸收、转运和代谢状态主要体现在血糖的含量变化上。胰岛素升高可帮助葡萄糖转运进入细胞，降低细胞中cAMP的浓度，加强糖原的合成。胰岛素与胰高血糖素比值的升高，可以表明机体合成代谢加强。随着奶牛即将分娩生理状态发生剧烈变化来适应分娩及泌乳需要，机体需要消耗大量的糖贮备，所以血糖呈现不断下降的趋势。

4 结论

围产期奶牛普遍存在低血糖，产前发病率高于产后。血糖浓度是低血糖症的特异性指标，血液TBIL、DBIL、IBIL、AST、TG、LDH、Ca、P 可 作 为 低血糖症的辅助性指标。本研究初步确定了低血糖症辅助性指标的cut-point，为低血糖的监测提供了参考数据。