Q热疫苗研究

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Q热(Q fever)为世界性分布的一种重要人兽共患病，分为急性和慢性两种类型。急性Q热主要临床表现为发热、头痛、肌肉酸疼，常并发肺炎、肝炎、心肌炎、甚至脑膜脑炎。急性Q热未完全治愈可发展为慢性Q热[1]。贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)为Q热病原体，一种专性吞噬细胞内寄生的嗜酸性革兰阴性小球杆菌。贝氏柯克斯体具有感染力强、气溶胶传播、理化因素抵抗强、易于储存等特点，已被有关国际组织认定为重要生物战剂和生物恐怖剂[2]。

贝氏柯克斯体能够引起家畜(特别是牛羊)感染，感染的家畜(特别是孕畜和产奶畜)为人类Q热暴发流行的最主要的传染源[3]。2007-2010年，荷兰多家农场暴发羊群贝氏柯克斯体感染，并引发人群Q热大暴发。荷兰Q热大暴发更加使人们认识到Q热暴发流行对现代社会严重危害以及加强Q热预防重要性。

预防Q热最有效手段是疫苗接种。为了对付外来贝氏柯克斯体生物武器/生物恐怖剂的攻击，以及为预防贝氏柯克斯体对人和家畜的自然感染，美国、澳大利亚、俄罗斯、捷克、荷兰等国家进行了Q热疫苗研究[2-4]。我国为畜牧业生产大国，很多地区存在牛、羊的贝氏柯克斯体感染，人的贝氏柯克斯体感染在我国也普遍存在。因此，我国有必要研发Q热疫苗以应对可能发生的Q热暴发。

1　灭活贝氏柯克斯体

1965年，前苏联研制了口服减毒Q热疫苗(M-44)，由于它能够在体内长期存活，毒性恢复可能性使得它不能用于对人免疫[4]。1989年，澳大利亚学者采用甲醛灭活I相贝氏柯克斯体(Henzerling株)生产灭活Q热疫苗(Q-Vax)，Q-Vax是目前世界上唯一获得药监部门批准文号的人用Q热疫苗，在澳大利亚已经用于畜牧业和屠宰业的Q热易感人群的预防接种10多年，免疫保护效能几乎为100%[5]。但是，由于Q-Vax接种动物引起发热、肝、脾损伤，接种人引起局部红肿和形成硬结等，特别是它可引起Q热抗体阳性者严重全身反应，因此需要筛选接种人群[5-7]。

灭活II相贝氏柯克斯体免疫也能诱导机体产生特异性免疫，但是不能有效抵抗I相贝氏柯克斯体感染。I相贝氏柯克斯体为强毒株，II相贝氏柯克斯体为弱毒株，I相菌株具有完整的I相脂多糖并能够诱导机体产生I相和II相特异性抗体，II相菌缺乏完整的脂多糖，仅能诱导机体产生II相特异性抗体[8]。Peng等[9]研究证明I相脂多糖特异抗体或单克隆抗体能够有效地中和I相贝氏柯克斯体，阻止其对巨噬细胞的入侵。

2　化学提取组分疫苗

上世纪80年代末， Williams等采用氯仿—甲醇提取I相贝氏柯克斯体(Nine Mile株)，获得提取后的组分(chloroform-methanol residual, CMR)做疫苗[7]。采用CMR接种的小鼠、豚鼠、猴、志愿者，攻毒试验证明CMR免疫效果与Q-Vax相当，但局部和全身不良反应显著减轻[6-7]。王锡乐等[10-11]采用中国分离I相贝氏柯克斯体(新桥株)研制出CMR疫苗；免疫动物实验证明其具有用新桥株制备的灭活疫苗一样好的免疫保护效能，其免疫副作用则显著低于灭活疫苗。孙长俭等[12]采用高压气相色谱分析新桥株制备的CMR疫苗和灭活疫苗，发现灭活疫苗经氯仿-甲醇提取后，能够除去多种脂肪酸和显著减少某些脂肪酸含量，这些脂肪酸的消除与减少可能是CMR疫苗诱导的局部和全身不良反应消失或减轻的主要原因。

上世纪70年代初，前捷克斯洛伐克学者采用三氯醋酸提取I相贝氏柯克斯体，获得可溶性三氯醋酸提取物(trichloroacetic acid extract)。化学分析显示三氯醋酸提取物含有蛋白和脂多糖，凝胶电泳和质谱分析从中鉴定39个蛋白，其中15个为免疫原性蛋白[13]。用三氯醋酸提取物免疫小鼠和兔，免疫动物产生贝氏柯克斯体I和II相抗体以及特异性细胞免疫应答。采用三氯醋酸提取物对1 700多人进行免疫，证明其有良好的免疫保护效能但没有明显副作用[13]。

3　贝氏柯克斯体重组蛋白抗原

Zhang等[14]采用分子生物学技术克隆和表达了贝氏柯克斯体主要表面抗原，包括27 kD Com1、30 kD P1、34 kD SP34、60 kD热休克蛋白B(HspB/GroEL)等。Deringer等[15]采用Q热患者血清做贝氏柯克斯体(Nine Mile株)免疫蛋白质组分析，总共鉴定14个免疫优势蛋白抗原，其中8个为I相和II相菌共有蛋白(EF-Tu、GplK、Mdh、DnaK、EF-Ts、SucD、SucB、Com1)，2个I相菌特有蛋白(YbgF I和AhpC/Tsa I)和4个为II相菌特有蛋白(Peptidase M20A family、Rph RNase、Arabinose-5-phosphate isomerase、Hypothetical exported protein)。熊小路等[16]用贝氏柯克斯体感染小鼠血清和Q热患者血清对贝氏柯克斯体(新桥株)做免疫蛋白质组分析，鉴定7个免疫优势蛋白抗原(GroEL、YbgF、RplL、Mip、OmpH、Com1、Dnak)。王锡乐等[17]依据贝氏柯克斯体全基因组序列，克隆和表达贝氏柯克斯体毒力和毒力相关基因，制备了104个贝氏柯克斯体毒力和毒力相关重组蛋白，并用这些重组蛋白构建了贝氏柯克斯体蛋白芯片。用贝氏柯克斯体感染小鼠血清从蛋白芯片中筛选出16个血清学反应强阳性蛋白抗原(HspB、Kate、GacA、ApaH、MgsA、SecA、BipA、Lo1A、Ihf-β、Ank4、SecB、Ank2、AhpC-Ts2、EnhA、IcmO、Com1)。焦俊等[18]采用生物素-链亲和素亲和层析以及蛋白质组学技术分离鉴定37个贝氏柯克斯体表面蛋白，并制备出一张含30个贝氏柯克斯体表面蛋白的蛋白芯片；用贝氏柯克斯体感染小鼠血清和Q热患者血清分析该蛋白芯片，结果23个表面蛋白与半数以上的贝氏柯克斯体感染小鼠4周血清反应阳性，其中15个表面蛋白与半数以上的Q热患者血清反应阳性。

血清学反应阳性蛋白能够诱导机体免疫应答产生特异性抗体，因此采用这些阳性蛋白免疫动物，然后用I相贝氏柯克斯体毒株攻击免疫小鼠，以便发现能够给予机体特异性免疫保护的保护性抗原。张晶波等[19]建立了贝氏柯克斯体感染BALB/c小鼠动物模型以及检测贝氏柯克斯体的荧光定量PCR，使评价各种免疫原的抗贝氏柯克斯体免疫保护效能更简便和准确。熊小路等[20]将GroEL、Mip、Com1等重组蛋白体外刺激BALB/c小鼠骨髓源树突细胞(murine bone marrow-derived dendritic cells， BMDC)，然后将不同抗原刺激的BMDC分别经腹腔注入正常BALB/c小鼠，攻毒结果显示Mip或Com1刺激BMDC受体小鼠的贝氏柯克斯体载量显著低于对照，首次证明外膜蛋白Mip和Com1能够激活树突状细胞、诱导机体产生有效的抗贝氏柯克斯体免疫应答。

尉雁等[21]研究证实灭活II相贝氏柯克斯体比I相贝氏柯克斯体能更有效激活BMDC，接受II相激活BMDC小鼠的抗贝氏柯克斯体感染能力明显强于I相菌激活BMDC受体小鼠，证明脂多糖缺陷II相菌暴露的表面蛋白能够有效激活BMDC，激活BMDC再将T细胞等免疫活性细胞激活。尉雁等[21]将贝氏柯克斯体3个重组蛋白抗原(Com1、SecB、EnhA)分别刺激BMDC，结果Com1或SecB刺激BMDC受体小鼠能有效抵抗贝氏柯克斯体感染，而EnhA刺激BMDC受体小鼠则不能。他们进一步发现保护性抗原Com1或SecB激活BMDC的能力显著强于EnhA，能够诱导BMDC产生高水平IL-6和IL-12p40和低水平的IL-10，从而驱使CD4+T细胞向Th1(IFN-γ)和Th17细胞而不向Th2(IL-4)和Treg细胞分化。王颖等[22]研究发现保护性抗原Com1能有效激活人树突状细胞，激活树突状细胞则能激活抗原特异T细胞，使其朝着Th1 和Tc1分化。

热休克蛋白能增强抗原递呈细胞对抗原的处理和递呈，有效激活树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、特别是抗原特异T细胞，从而产生多种细胞因子去激活和调节先天性和获得性免疫应答[23]。李青凤等[24]采用分子克隆技术制备出贝氏柯克斯体P1蛋白抗原与热休克蛋白HspB的融合蛋白(P1-HspB)。用P1-HspB融合蛋白免疫BALB/c小鼠，攻毒后发现其免疫保护效能显著好于单独P1蛋白抗原免疫，提示热休克蛋白HspB的融合能够显著提升P1蛋白抗原的免疫保护效能。进一步分析发现P1-HspB融合蛋白诱导小鼠产生的特异性抗体水平显著高于P1蛋白，其免疫小鼠的脾淋巴细胞增殖水平以及脾细胞分泌的IL-2和IFN-水平均显著高于P1蛋白抗原单独免疫[10]。

4　贝氏柯克斯体T细胞表位

对灭活I相贝氏柯克斯体疫苗的免疫保护机制研究发现，I相贝氏柯克斯体诱导的体液免疫在控制贝氏柯克斯体早期感染起重要作用，但是如果贝氏柯克斯体侵入宿主细胞，宿主细胞内的贝氏柯克斯体清除则依赖T细胞介导的特异性免疫应答[8,25]。机体T细胞介导的特异性免疫应答依赖贝氏柯克斯体的CD4+和CD8+T细胞表位诱导。

4.1CD4+T细胞表位 Chen等[26]从贝氏柯克斯体免疫优势蛋白抗原中筛选出CD4+T细胞优势表位。熊小路等[27]通过T细胞表位在线预测软件分析贝氏柯克斯体7个免疫优势蛋白抗原(Com1、GroEL、Mip、OmpA、OmpH、P1、YbgF)的H2-Ab限制型CD4+T细胞表位，预测出121条15个氨基酸长的CD4+T细胞表位。将人工合成的121条CD4+T细胞表位肽分别与同源重组蛋白免疫小鼠的CD4+T细胞共孵育，然后用酶联斑点(ELISPOT)法评价它们诱导致敏CD4+T细胞表达IFN-γ的能力。ELISPOT分析筛选出22条能够诱导致敏CD4+T细胞分泌高水平IFN-γ的免疫优势CD4+T细胞表位肽。将这22条免疫优势CD4+T细胞表位肽再分别刺激贝氏柯克斯体全菌抗原免疫小鼠CD4+T细胞，经ELISPOT评价从中筛选出7条源自不同蛋白抗原的免疫优势CD4+T细胞表位肽。

熊小路等[27]将这7条免疫优势CD4+T细胞表位肽单独或联合刺激贝氏柯克斯体全菌免疫小鼠脾细胞，用流式细胞术分析脾细胞中CD4+T细胞的IFN-γ和TNF-α表达。结果显示7条免疫优势CD4+T细胞表位肽均能诱导高比例CD4+T细胞表达IFN-γ。此外，这7条免疫优势CD4+T细胞表位肽联合诱导CD4+T细胞表达IFN-γ的水平显著高于单条表位肽，提示多条免疫优势表位肽联合激活CD4+T细胞的效能显著好于单个表位肽。将这7条免疫优势CD4+T细胞表位肽单独或联合免疫C57BL/6小鼠，攻毒结果显示CD4+T细胞表位肽联合免疫小鼠的贝氏柯克斯体载量显著低于单个表位肽，证明多条免疫优势CD4+T细胞表位肽联合免疫效果显著好于单条肽[27]。

4.2CD8+T细胞表位 熊小路等[28]通过T表位在线预测软件分析贝氏柯克斯体的24个分泌蛋白和6个免疫优势外膜蛋白的CD8+T细胞表位，预测出157条H2-Kb、Db限制型9氨基酸长的CD8+T细胞表位。将人工合成的157条CD8+T细胞表位肽分别刺激贝氏柯克斯体感染小鼠CD8+T细胞，通过ELISPOT分析筛选出29条能诱导致敏CD8+T细胞分泌高水平IFN-γ的免疫优势表位肽；随后将这29条免疫优势表位肽分别刺激贝氏柯克斯体感染小鼠CD8+T细胞，流式细胞术分析显示这些免疫优势表位肽均能诱导CD8+T细胞表达IFN-γ[28]。

4.3李斯特疫苗菌表达CD8+T细胞表位肽 将单核细胞增生性李斯特杆菌(Listeria monocytogenes，LM)2个与感染以及自身扩散相关的天然毒力因子Internalin B和Act A敲除，构建出不引发机体感染的LM疫苗菌。LM具有细胞内长生命周期和强靶向树突状细胞能力，可诱导机体产生强烈的细胞免疫应答[29]。熊小路等[28]将29条贝氏柯克斯体免疫优势CD8+T细胞表位基因串联后与表达质粒重组，重组表达质粒转化LM疫苗菌制备出表达贝氏柯克斯体CD8+T细胞表位的LM疫苗菌(LM-Cb)。用LM-Cb免疫C57BL/6小鼠，攻毒结果显示LM-Cb免疫小鼠的贝氏柯克斯体载量显著低于空质粒转化LM疫苗菌免疫小鼠或非免疫小鼠，证明LM-Cb能够诱导机体产生有效抗贝氏柯克斯体免疫应答[29]。

5　结　语

由于贝氏柯克斯体是专性细胞内寄生菌，不管是灭活还是化学提取Q热疫苗，均需要用鸡胚大量培养贝氏柯克斯体，然后在高等级生物防护实验室内采用复杂步骤从鸡胚中提取、纯化贝氏柯克斯体，这些使Q热疫苗的生产成本高启且难以工厂化生产。近十多年来，国内外有关学者着力研究分子Q热疫苗，已经从研究贝氏柯克斯体保护性抗原转移到研究诱导特异性细胞免疫应答的T细胞表位上，期望贝氏柯克斯体CD4+和CD8+T细胞表位在体内高效表达，诱导机体产生良好的抗Q热免疫应答。

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