不同训练状态大鼠心肌GRP78、GRP94和ERP72的表达

史清钊　陈怡月　王智强　李丁丁　于海燕　姚政立　王蕴红

摘 要： 探讨运动诱发心肌适应过程中是否有心肌内质网应激的参与。方法：大鼠进行跑台耐力训练，建立不同训练强度、不同训练时间和周期的大鼠运动模型，在末次训练结束后24 h取材，取左室心肌，采用western blot检测内质网应激相关蛋白GRP78、GRP94、ERP72和CHOP的表达。结果：1）5周运动模型组：时间递增组大鼠心肌GRP78较安静组显著升高，GRP94、ERP72、CHOP蛋白表达无显著性差异；恒时恒速组、速度递增组大鼠心肌GRP78、GRP94、ERP72、CHOP蛋白表达较安静组未见显著性差异。2）10周运动模型：恒时恒速组、速度递增组大鼠心肌GRP78、GRP94、ERP72、CHOP蛋白表达较安静组无显著差异。结论：以延长运动持续时间为特征的5周耐力训练诱发GRP78蛋白表达升高，而速度恒定或速度递增的耐力训练没有诱发心肌与内质网应激相关的蛋白表达，提示运动方式可能与心肌内质网应激有关。

关键词：运动；心肌；内质网应激；葡萄糖调节蛋白78

中图分类号：G 804.2 学科代码：040302 文献标识码：A

Abstract：Objective： To explore whether endoplasmic reticulum stress is involved in the process of exercise-induced myocardial adaptation. Methods： Rats were subjected to treadmill exercise training with different exercise intensity， duration and exercise program， and then euthanized 24h after last run. GRP78， GRP94 and ERP72 expressions in myocardium of left ventricular were measured with western blot analysis. Results： 1） there was a significant increase in the GRP78 expression but no significant difference in the expression of GRP94， ERP72， CHOP in duration-increase group. No significant changes in the expression of GRP78， GRP94， ERP72 and CHOP protein expressions in rats undergoing constant speed and speed-increase training were observed in all rats of 5-week trained groups； 2） No significant changes in the expression of GRP78， GRP94， ERP72 and CHOP were observed in all rats of 10-week trained groups when compared with age-matched control group. Conclusion： GRP78 expression was induced in rat myocardium after five-week duration-increase endurance training， while no significant change in GRP78 expression was observed after constant speed or speed-increase training. It suggests that exercise mode might be associated with exercise-induced endoplasmic reticulum stress.

Keywords： exercise； cardiac muscle； endoplasmic reticulum （ER）；glucose-regulated protein 78

內质网应激反应（ERS）可由缺氧、供能状态变化及生长刺激因子等生理因素启动，适度的内质网应激反应，能够提高对应激刺激的耐受力，有利于细胞内钙和蛋白质加工等稳态的恢复 [1-4]。研究表明，阻抗运动能够诱发骨骼肌内质网应激信号通路的激活，提示内质网应激与运动适应有密切关系[5]；但有关运动诱发心肌内质网应激的研究还鲜见报道。已有研究证明，内质网应激参与了压力超负荷、机械应力等引起心肌损伤和心肌肥大的发生发展[6]，并且我们前期的研究也显示，长时间的耐力运动导致与内质网应激相关的eIF2/ATF4信号通路激活[7]，提示运动可能引起心肌的内质网应激。但也有研究报道了不同的结果[8]。由于成熟的心肌细胞是终末分化细胞，细胞内钙和蛋白质质量的改变直接影响到心肌结构和功能，而内质网不仅对应激刺激非常敏感[9]，而且在调控细胞内钙稳态、蛋白质合成和细胞凋亡中发挥重要的作用；因此，研究运动训练是否诱发心肌内质网应激的发生，将有助于我们认识运动心肌适应及心肌损伤的发生机制。为此，我们通过测定不同训练负荷、强度、时间和运动周期的耐力训练模型的心肌内质网应激的相关指标，来探讨运动训练的诸因素在诱发心肌内质网应激中可能发挥的作用，以揭示内质网应激机制是否参与运动训练导致心肌适应的过程及其可能的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

8周雄性SPF级Sprague Dawley大鼠52只，体质量（230±14）g，由北京维通利华实验动物技术中心提供（动物合格证号SCXK（京）2015-0004）。标准啮齿类动物饲料分笼饲养，自由进食和饮水，动物饲养环境为动物房温度23 ～25 ℃，相对湿度在45%～55%。每天光照和黑暗交替各12 h。

1.2 运动模型建立

大鼠经过适应性饲养后，随机分为5周训练模型（安静对照组6只、速度递增组8只、恒时恒速组8只、时间递增组8只）和10周训练模型（安静对照组6只、恒时恒速组8只、速度递增组8只）。采用跑台训练建立模型，每周训练5 d。由于我们以往的研究发现，采用该运动方案训练能够引起心肌蛋白质合成相关信号分子激活水平的变化[10-11]，因此，采用上述模型，便于观察不同训练方式、负荷和训练周期对心肌的作用效果[3]。5周运动模型的建立参照本实验室已有模型，即：运动组大鼠先完成为期3周的速度递增的训练，使每天训练时间达到1 h，运动速度从12 m/min逐渐增到24 m/min，再分成3组——速度时间不变组（C），速度递增组（S）和时间递增组（D）进行为期2周的训练，见表1。 10周的运动训练模型则分为速度递增组和恒速组进行训练。速度递增组的运动速度每周增加约3 m/min， 在运动训练到10周时达到34～36 m/min，而恒速组则在第2周达到24 m/min，以此速度运动直到10周，见表2。运动组大鼠在末次训练后24 h与对照组大鼠同时取材，低温生理盐水冲洗心脏，滤纸吸干后称全心和左心重，将左室心肌-80 ℃保存。

1.3 Western blot检测

称取适量心肌组织，按重量：体积比为1∶9加入预冷的细胞裂解液，冰上匀浆，静置20 min，4 ℃，13 000 r/min离心20 min。取上清 BCA法蛋白定量。以裂解液调整蛋白浓度，加入5X上样缓冲液，使样品终浓度为4 ？滋g/？滋L。95 ℃，煮沸10 min后，制成电泳上样液。配置12%的SDS-PAG分离胶和5%浓缩胶，加样电泳，电泳后将蛋白转至NC膜。将膜在一抗中孵育，4 ℃过夜。一抗溶于封闭液，GRP78（Abcam，ab21685）1∶4 000稀释，GRP94（CST， 2104）1：4 000；ERP72（CST，5033）1∶4 000，CHOP（GeneTex，GTX112827）1∶2 000；GAPDH（TDY042）1∶20 000；β-tubulin（TDY043）1∶5 000。洗膜后在二抗（中杉金桥公司提供，1∶5 000用封闭液稀释）中室温孵育2 h；洗膜后采用ECL发光试剂与膜在暗室中反应曝光、显影、定影。胶片扫描后，运用Image J软件处理后，使用TotaLab Quant软件系统进行图像分析，计算目的蛋白和内参蛋白条带灰度值，并用目的蛋白的灰度值与相应的内参蛋白灰度值对比，得出每个样品目的蛋白的相对含量。

1.4 数据处理

实验数据以均值±标准差或标准误表示，采用SPSS 19.0统计学软件对实验结果进行单因素方差分析。先进行方差齐性的显著性检验，若方差齐时，用LSD法检验；若方差不齐时，用Tamhanes法检验，显著性水平取P<0.05 。

2 结果

2.1 大鼠左心质量和左心系数

由表3可知，经过5周的运动训练，速度递增组与时间递增组的大鼠体质量增长与安静组比较，差异显著（P<0.05），并且速度递增组和时间递增组大鼠的左心系数与安静对照组相比，差异显著（P<0.05）；而恒时恒速组的体质量、左心系数与安静对照组相比，均无显著性变化（P>0.05）。速度递增组、恒时恒速组、时间递增组的左心系数比较，未见显著差异（P<0.05）。

由表4可知，经过10周的运动训练，速度递增组、恒时恒速组的左心质量与安静对照组比较，均无显著变化（P>0.05）。与安静组相比，速度递增组、恒时恒速组的左心系数均呈现显著差异（P<0.05）。

2.2 5周模型大鼠心肌GRP78、GRP94、ERP72、CHOP蛋白的表达

经过5周的运动训练，大鼠心肌中GRP78蛋白表达在时间递增组的表达量显著高于安静组（P<0.05）；而恒时恒速组和速度递增组的GRP78蛋白表达水平与安静组大鼠比较，未见显著变化（P>0.05）。时间递增组、恒时恒速组和速度递增组的GRP94、ERP72、CHOP蛋白表达与安静组大鼠比较，未见显著变化（P>0.05），如图1所示。

2.3 10周训练大鼠心肌GRP78、GRP94、ERP72、CHOP蛋白表达

经过10周的运动训练，恒时恒速组、速度递增组大鼠心肌中的GRP78、GRP94、ERP72、CHOP蛋白表达量与安静组比较，未见显著差异（P>0.05），恒时恒速组与速度递增组彼此之间比较，未见显著差异（P>0.05），如图2所示。

3 讨论

已有研究显示，心肌在机械牵拉、容量或压力超负荷时，可诱发内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）[12]，UPR首先通过激活PERK/eIF2α信号通路引起新的蛋白质翻译启动，并通过诱导参与蛋白质合成、折叠和钙稳态调节的相关蛋白表达上调，以终止内质网应激反应，恢复ER的功能。这些蛋白包括GRP78、GRP94、内质网蛋白（ERP）72等[6]，因此，這些蛋白表达的升高是内质网应激的一个重要标志[13]。

本实验结果显示，以延长运动时间为特征的递增负荷耐力训练可诱发GRP78表达升高。我们以往的研究也表明，以延长运动时间为特征的耐力训练可诱发eIF2α/ATF4激活水平提高[3]，而PERK/eIF2α/ATF4信号通路是内质网整合应激反应的重要的信号通路[13]，当内质网内未折叠蛋白聚集，并与GRP78结合，能够活化PERK，进而磷酸化eIF2α由于该信号通路的激活水平提高，蛋白质合成减少[14-15]。我们在同一模型上的研究也观察到耐力训练大鼠心肌mTOR/P70S6K激活水平的下降，提示运动心肌蛋白质合成的降低，可能与诱发心肌内质网应激有关。研究表明，当GRP78表达升高时，其与错误折叠或未折叠蛋白结合，以降低内质网中未折叠蛋白的积累，起到恢复内质网的功能，保护细胞存活的作用[4]。GRP78是HSP家族的成员，它在安静状态即有表达，并且当饥饿、衣霉素、钙离子载体A23187或高温（40 ℃）等干预因素作用时表达提高[16]，但运动训练的心肌是由哪些因素诱发其表达，还未见报道。此外，有研究显示，GRP78参与细胞的信号转导调节，并且受到其他信号分子如IGF-1以及胰岛素等介导的信号通路的调节[17-18]。而这些信号在运动训练中的活性变化对GRP78表达的作用也有待进一步研究。

在內质网应激时，除了引起GRP78蛋白表达升高外，还能够诱导包括伴侣蛋白GRP94、ERP72等其他参与蛋白质合成、折叠和钙稳态调控的蛋白表达升高，并且当内质网应激反应剧烈时，与内质网应激相关凋亡分子CHOP蛋白也会表达提高[15]。但在本实验中，即使是延长运动时间的耐力训练组大鼠，也未观察到心肌GRP94、ERP72、CHOP蛋白表达的上调，提示运动诱发的心肌细胞的内质网稳态并未发生细胞稳态的剧烈变化。同时本实验还观察到，5周递增速度和恒速组的大鼠继续训练到10周，无论是恒速还是递增速度训练，心肌GRP78表达及GRP94、ERP72、CHOP蛋白的表达与安静对照组相比均未出现明显变化，ERP72也只在10周递增负荷运动心肌表达升高，提示耐力训练所诱发的内质网应激相关蛋白表达只与运动方式、运动负荷有关。有研究证明，短期的内质网应激所诱发的未折叠蛋白反应，能够清除错误折叠蛋白，对细胞的存活起到保护作用，是细胞的适应反应，而长时间的内质网应激时，则导致细胞功能障碍，甚至细胞死亡[12，19]。因此，上述结果也表明，运动应激与缺血缺氧等病理因素所导致的内质网应激反应存在本质上的差异。最近的研究还发现，GRP蛋白能够主动移位到细胞其他的部位，如细胞表面，参与细胞的信号转导、扩增、凋亡和免疫的调节[20]，这也提示它们在运动心肌适应中可能存在较为广泛的作用，运动训练是通过何种机制引起心肌内质网的应激蛋白表达，有待于进一步研究。

综上所述，本研究结果显示，以延长运动时间为特征的耐力训练可能诱发心肌内质网应激。这种运动诱发的内质网应激与运动的方式和训练量相关的内质网应激蛋白表达可能对细胞的稳态起到保护作用。

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