高强度间歇训练对大鼠心肌线粒体呼吸链复合体活性的影响

王增喜 李洁 王悦

1西北师范大学体育学院（兰州 730070）2甘肃警察职业学院（兰州 730046）

心肌肥大是由于心肌纤维受到病理性（如冠心病、高血压、主动脉缩窄等）或生理性（如长期规律运动训练）刺激而发生的一种结构代偿性反应，相应的分为病理性和生理性心肌肥大两种类型。病理性心肌肥大最终由于心功能失代偿而发生心力衰竭，而生理性心肌肥大时心功能正常或显著改善。心脏是人体耗氧量最大的器官，线粒体则是心肌能量产生的主要场所，通过其呼吸链的氧化磷酸化作用生成ATP为心肌细胞提供生命活动所需的能量，不同类型心肌肥大时往往伴随线粒体结构与功能的差异性改变[1]。

研究发现[2]，体力活动具有健康促进作用，且运动强度与有氧运动能力呈现剂量-反应关系，高强度运动的心脏健康效应是中等强度的2倍。然而亦有研究证实[3-7]，高强度运动可造成心肌损伤和病理性重塑，增加某些易感者心源性猝死与心肌梗塞等心血管不良事件的发生风险。因此，运动的健康效应可能存在“强度阈值”（intensity threshold），超出这一阈值则造成负面效应（适应不良）。高强度间歇训练（high intensity interval training，HIIT）是一种省时有效的运动模式，2周HIIT（3次/周）即可改善健康无训练经历受试者[8]、慢性病患者[9]甚至运动员[10]的运动能力，与传统持续中等强度训练（moderate intensity continuous training，MICT）产生相似的骨骼肌适应，然而不同运动方式对心肌的作用尚未明确。值得注意的是，多项针对HIIT和MICT的对比研究均以一次急性运动后即刻或运动结束后24～48 h进行观察[11-14]，而长期运动过程中不同阶段心脏和线粒体功能的变化鲜有关注。本研究旨在探讨长期HIIT和MICT诱导大鼠运动性心肌肥大过程中心功能以及线粒体呼吸链活性的变化。我们假设，10周不同方式运动诱导心脏生理性肥大，同时心功能增强，线粒体呼吸链复合体活性上调。

1 研究对象与方法

1.1 实验动物

90只健康SPF级雄性Wistar大鼠，2月龄，购自甘肃中医学院实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（甘）2005-0007。分笼饲养，每笼5只。国家标准啮齿类动物饲料喂养，自由进食水，室温23±2℃，相对湿度（50 ±10）%，12/12 h光暗交替。

1.2 动物分组与运动方案

将大鼠随机分为HIIT组、MICT组和安静对照组（rest control，RC），每组按照观察时间点（2周、6周和10周）再分为3个亚组，共9组，每组n＝10。RC组大鼠保持安静状态，HIIT组和MICT组动物参考Kemi等[11]的运动方案（稍作修饰）并根据Bedford等[15]关于大鼠体重/摄氧量回归方程确定跑台坡度和速度，进行5 d/周、共10周的跑台训练。大鼠先以50%VO2max（8 m/min，0°）进行10 min热身，随后开始正式训练：HIIT组以90%VO2max（27 m/min，10°）运动4 min，间歇期以50%VO2max（8 m/min，0°）继续运动2 min，重复7个循环；MICT 组以 65%VO2max（15 m/min，5°）持续运动50 min。HIIT组和MICT组总运动负荷（运动强度×运动时间×运动频率）基本保持一致，即HIIT组运动负荷＝（0.9×4+0.5×2）×7×5＝161，MICT组运动负荷＝0.65×50×5＝162.5。

1.3 心脏结构与功能检测

利用超声心动图检测大鼠心脏结构与功能。动物麻醉后取仰卧位，胸部备皮，探头频率为12 MHz，取左心室乳头肌水平进行二维短轴扫描（M超），扫描速度100 mm/s。检测指标包括：左心室舒张末期内径（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）、左心室收缩末期内径（left ventricular end-systolic dimension，LVESD）、左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）和左心室缩短分数（left ventricular fractional shortening，LVFS）。

1.4 取材、线粒体制备以及柠檬酸合酶（citrate syne syn--thasethase，CSCS）活性测定

动物末次训练后24 h于安静状态下称量体重（body weight，BW），随后断头处死动物，迅速取心脏称重（heart weight，HW）后转移至预冷的心脏停搏液中，去掉心房，将心室肌剪碎。按照每g心肌加入10 mL匀浆缓冲液（10 mmol/L Tris-HCl、5 mmol/L EDTA、250 mmol/L蔗糖、pH值7.4）的比例混匀后匀浆30 s（9000 rpm），取2 mL匀浆液待用。线粒体制备：剩余匀浆液离心10 min（800 g）后取上清，12000 g离心15 min弃上清，沉淀物加入适量缓冲液（100 mmol/L KCl、50 mmol/L MOPS、0.5 mmol/L EGTA、pH 值7.4）充分悬浮后12000 g离心15 min，所得沉淀物即为线粒体[16]。以牛血清白蛋白为标准，Bradford法测定线粒体蛋白浓度。利用酶联免疫吸附试验（ELISA）分别测定心肌匀浆液以及线粒体柠檬酸合酶（citrate synthase，CS）活性。

1.5 线粒体呼吸链复合体活性测定

参照课题组前期建立的方法[16]用分光光度法测定线粒体呼吸链复合体（Ⅰ～Ⅳ）活性。将10～20 μg线粒体蛋白加入终体积为2 mL的缓冲液中，以蒸馏水作为空白管，校正吸光度到0点，分别测定 340、600和550 nm处 3 min吸光度值。测试仪器为UVmini-1240岛津紫外可见分光光度计。

1.6 心脏蛋白表达水平测定

Western blot法检测心肌过氧化物酶体增生物激活受体 1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α）、α-肌球蛋白重链（αmyosin heavy chain，α-MHC）、β-MHC、心钠素（atrial natriuretic factor，ANF）和脑钠素（brain natriuretic peptide，BNP）蛋白相对表达量，β-actin定为内参蛋白。SDS-PAGE分离蛋白样品，PVDF转膜后加入一抗孵育12 h，二抗孵育1 h，ECL显影。采用Quantity One软件扫描各条带灰度值。以RC组蛋白相对灰度值为1，计算HIIT组和MICT组目的蛋白相对灰度值与RC的比值，即为其相对表达量。

1.7 统计学处理

所有实验数据用“算术平均数±标准差”表示，同一时间点组间比较使用独立样本t检验，同组不同时间点比较使用单因素方差分析，多重比较使用LSD检验。统计软件为SPSS 15.0 for Windows。P＜0.05表示差异具有显著性。

2 结果

2.1 最终样本量

实验过程中，由于拒跑、死亡等原因共剔除8只大鼠，最终纳入统计的样本量为n＝82。2周时：RC组n＝10、HIIT组n＝9、MICT组n＝10；6周时：RC组n＝10、HIIT组n＝9、MICT组n＝8；10周时：RC组n＝10、HIIT组n＝8、MICT组n＝8。

2.2 体重和心脏重量的变化

2周和6周时，HIIT组HW高于RC组和MICT组（P＜0.05），HW/BW高于RC组（P＜0.05）；10周时，HIIT组和MICT组BW、HW/BW高于RC组（P＜0.05）。见表1。

表1 体重和心脏重量的变化

2.3 心脏结构与功能的变化

2周和10周时，各组心脏结构与功能均无显著性差异（P＞0.05）；6周时，HIIT组LVEDD和LVESD高于RC组和MICT组（P＜0.05），LVEF和LVFS低于RC组和MICT组（P＜0.05）。见表2。

2.4 CSCS和线粒体呼吸链复合体活性的变化

各时间点各组心肌和线粒体CS活性均无显著性差异（P＞0.05）。见表3。6周时，HIIT组CⅠ、CⅢ和CⅣ活性低于RC组和MICT组（P＜0.05），2周和10周时各组CⅠ、CⅢ和CⅣ活性均无显著性差异（P＞0.05）；各时间点各组CⅡ活性均无显著性差异（P＞0.05）。见图1。

表2 心脏结构与功能

表3 心肌和线粒体CS活性的变化

图1 线粒体呼吸链复合体CⅠ（a）、CⅡ（b）、CⅢ（c）和CⅣ（d）活性的变化

2.6 蛋白表达的变化

2周和10周时，各组心肌PGC-1α、α-MHC、β-MHC、ANF和BNP蛋白表达均无显著性差异（P＞0.05）；6周时，HIIT组α-MHC低于RC组和MICT组（P＜0.05），β-MHC和BNP高于RC组和MICT组（P＜0.05）。见图2。

图2 心肌PGC-1α（a）、α-MHC（b）、β-MHC（c）、ANF（d）和BNP（e）蛋白表达的变化

3 讨论

本研究结果部分验证了前述假设，即10周不同方式运动（HIIT和MICT）均可诱导大鼠心肌生理性肥大；然而6周HIIT则造成心功能降低，心肌α-MHC表达上调而β-MHC和BNP表达下调，同时伴随CⅠ、CⅢ和CⅣ活性下降，MICT组各指标均无显著性变化。上述结果提示，长期运动训练能够诱导大鼠病理性心肌肥大，其机制可能与心肌线粒体呼吸链复合体活性下调有关，这一现象呈现运动强度依赖性和暂时可逆性特征。

多项研究证实，HIIT和MICT能够诱导相似的骨骼肌生理适应，包括线粒体数量增加、氧化酶活性上调、糖原含量升高等，然而两种运动方式对心肌的作用是否存在差异尚未明确。Hafstad等[12]发现，10周HIIT和MICT均可通过改善线粒体功能、减轻氧化应激而抑制肥胖小鼠心脏重塑；有研究发现[17，18]，MICT能够增加健康青年每搏输出量并减慢心率、降低心肌的能量需求，而HIIT则无上述效应；Lu等[13]让心梗后心力衰竭大鼠进行8周不同方式运动，结果发现，与MICT比较，HIIT能够显著改善心功能、有氧运动能力和心肌糖脂代谢并减轻氧化应激；Hafstad等[14]发现，10周HIIT和MICT虽然诱导相似的心肌肥大程度（HW/BW增加约10%），但HIIT能够显著改善线粒体功能、心肌代谢谱以及心肌收缩力；Kemi等[11]证实，心肌对于运动训练的适应呈现运动强度依赖性，即与MICT比较，10周HIIT能够更为显著地提高大鼠心肌肥大程度、心肌收缩力以及VO2max。研究结果不一致可能与实验对象、实验模型、运动方案以及干预时间等因素有关。值得注意的是，在 Hafstad 等[14]和 Kemi等[11]的研究中，由于 HIIT 和MICT运动时间和组数相同，使得两种方式的运动距离和总做功存在显著差异，因此HIIT的优势有可能是由于其总运动负荷高于MICT造成的。本研究设计的运动方案保证了HIIT组和MICT组运动负荷相匹配，结果发现，2周时HIIT组即发生心肌肥大，但心功能并无显著性变化，与Jacobs等[8]的研究一致，他们发现，2周HIIT后骨骼肌氧化能力提高，而心功能无显著性变化，提示短期HIIT的健康效应主要发生在外周水平（骨骼肌）。10周运动后，HIIT和MICT组大鼠BW、HW/BW高于RC组，同时心脏结构与功能以及胚胎基因（ANF、BNP、β-MHC）表达均无显著性差异，提示长期不同方式运动（HIIT或MICT）均可诱导生理性心肌肥大，这与前人的多项研究基本一致。然而亦有研究发现，高强度运动可造成心肌损伤，例如，运动员进行一次长时间、高强度剧烈运动后心脏出现暂时性收缩功能障碍[3-5]；大鼠被动运动（跑台或游泳）可引起应激激素（皮质酮、促肾上腺皮质激素）水平上调[19，20]以及心功能异常[21]；健康大鼠长期高强度运动能够诱导致心律失常性心肌重塑[6]；高血压大鼠长期高强度运动则进一步加速心脏病理性重塑[7]。本研究以健康大鼠为实验对象并发现，6周时HIIT组大鼠心肌收缩力下降，胚胎基因β-MHC重新激活并表达上调，收缩蛋白α-MHC表达下调。由于α-MHC上ATP酶活性是β-MHC的3倍，因此α-MHC→β-MHC亚型转变减弱了肌纤维收缩速率和心肌收缩力并导致心功能下降。心力衰竭标志物ANF和BNP水平升高与心功能下降密切相关。6周时HIIT组BNP升高，而ANF则无显著性变化。左心室扩张（LVEDD和LVESD增加）造成充盈压升高诱导心肌BNP释放，其作用在于舒张血管以及钠尿增多。ANF在运动中升高，运动后数小时即恢复至正常水平[22]，本研究中ANF无显著性变化可能与取材时间有关。上述结果表明，6周HIIT诱导心脏表型和基因型均发生病理性变化，即呈现病理性心肌肥大。针对心力衰竭模型的研究同样发现[23]，4周HIIT加速高血压大鼠病理性心脏重塑，表现为左心室肥大、BNP含量显著增加；然而ANF和β-MHC含量无显著性变化，其原因可能与心力衰竭处于早期阶段有关。本研究中，HIIT组在10周时心功能恢复，提示长期运动诱导的心肌适应不良与运动强度有关且呈现暂时性可逆性特征。

虽然诸多研究对生理性和病理性心肌肥大的生物学机制进行了深入探讨，然而目前尚无定论，有些结果甚至相互矛盾。线粒体功能在心肌能量代谢、信号转导、细胞增殖、生长以及凋亡中扮演关键角色，推测心肌肥大过程中线粒体的作用至关重要。生理性心肌肥大时，调控线粒体生物合成的主要调控因子-PGC-1α表达上调，同时线粒体数量增加、功能改善，呼吸链复合体活性升高，而病理性心肌肥大时则发生相反变化，即PGC-1α表达下降伴线粒体功能受损并最终导致心功能降低甚至心力衰竭[1]。因此我们针对长期运动过程中心肌线粒体生物合成调控蛋白（PGC-1）和标志物（CS）以及呼吸链复合体活性进行了深入探索，结果发现，6周时HIIT组出现病理性心肌肥大同时伴心肌线粒体呼吸链复合体活性下降，但心肌PGC-1α表达量和CS却无显著性差异。PGC-1α表达无变化的原因可能有三：第一，与取材时间有关。本研究在动物末次训练后24 h进行取材，因此与Ikeda等[24]针对骨骼肌的研究一致，他们证实，一次急性运动后12 h骨骼肌PGC-1α表达量上调，24 h恢复。第二，与PGC-1α亚细胞定位有关。安静状态下，PGC-1α主要存在于细胞浆中，运动应激诱导PGC-1α向核转位后发挥转录激活作用，因此，总PGC-1α蛋白含量并不能完全代表激活状态。Little等[25，26]证实，一次急性HIIT后3 h骨骼肌细胞核PGC-1α表达上调，而细胞匀浆液中PGC-1α总表达量并无显著性变化；2周HIIT上调骨骼肌细胞核PGC-1α含量，而总PGC-1α表达量则无显著性差异。第三，PGC-1α并非线粒体生物合成的唯一调节因子。有研究证实[27]，运动过程中在PGC-1α表达上调之前线粒体生物合成已经开始，提示线粒体合成受多种信号途径的调控，并不完全依赖于PGC-1α。Jacobs等[8]的研究同样指出，运动诱导的线粒体功能改变可能与线粒体相关基因表达的变化并不一致。CS是线粒体生物合成的标志物，6周时HIIT组心肌CS活性同样无显著性变化，可能是心肌拥有强大的氧化能力以提供运动时的能量需求。研究发现[28]，HIIT和MICT均可诱导骨骼肌CS活性增加，然而对于心肌，只有HIIT能够上调CS活性，提示心肌对于运动训练的可塑性不及骨骼肌，即运动诱导心肌发生反应和适应的阈值较高（敏感性较低）。

6周时HIIT组心肌线粒体呼吸链CⅠ、CⅡ和CⅣ活性下降，这与前人针对大鼠高强度运动模型以及力竭运动模型得到的结果基本一致。吕梅等[29]的研究表明，一次性力竭性运动引起大鼠肝脏线粒体NADHCoQ还原酶（即CⅠ）活性下降，致使胞浆内大量NADH无法进入呼吸链而堆积，线粒体氧利用能力降低。我们前期的研究发现[30]，运动性疲劳时骨骼肌呼吸链CⅢ活性下降。有趣的是，本研究中6周时HIIT组唯有CⅡ活性并无明显改变。线粒体蛋白受核基因组与线粒体基因组共同调控，而琥珀酸脱氢酶（即CⅡ）则是唯一完全由核编码的复合体，其他复合体均至少有一个亚基是由线粒体基因组编码，因此可以推测，线粒体调节受损可能发生在线粒体基因组水平而非核基因组。Huang等[21]的研究间接印证了这一点，即高强度运动时线粒体DNA缺失增加。我们推测，呼吸链复合体功能受损（活性下降），一方面线粒体功能下降，ATP生成量降低，心肌能量供应减少；另一方面，大强度运动消耗ATP同时产生大量次黄嘌呤核苷酸（inosine monophosphate,IMP），进而增加活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量，继之引起细胞损伤和凋亡并上调低氧诱导因子（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）表达，后者能够抑制线粒体生物合成[31]，HIF-1α上调说明心肌组织处于低氧状态，最终造成心肌受损以及心功能下降。

有关运动诱导心肌肥大的多项研究中往往仅选取末次训练后即刻或24～48 h作为观测点，加之运动方案不同，因此造成不同研究结果之间存在较大的异质性[11-14]。本研究选取多个观察点，结果显示，长期HIIT可暂时性造成心功能和线粒体功能下降，这一现象被多数学者所忽视。Marcil等[32]证实，10周运动后线粒体功能未发生显著性变化，而Terblanche等[33]报道，6周高强度耐力训练后氧化能力下降。上述结果与本研究基本一致，然而6周运动诱导的线粒体功能降低现象是否可逆以及10周运动过程中是否存在线粒体功能暂时性下降尚不得而知。Pereira等[28]的研究证实，13周HIIT和MICT均能够显著上调心肌和骨骼肌CS活性并改善线粒体功能；Ascensao等[34]发现，14周耐力训练后大鼠呼吸能力改善。结合本研究结果，我们推测，若训练时间继续延长3～4周，HIIT组大鼠线粒体呼吸链复合体活性可能显著升高。

4 结论与建议

长期HIIT（而非MICT）能够造成大鼠暂时性（可逆性）病理性心肌肥大以及心功能降低，其机制可能与心肌线粒体呼吸链复合体活性下调有关。本研究结果提示，从事健身者若实施HIIT，应循序渐进地增加运动负荷并加强医务监督，无训练经历者尤其患有慢性病（心血管疾病、代谢性疾病等）者应在适当监控下进行，同时通过营养（如线粒体营养素）等手段改善线粒体功能，以降低氧化损伤、避免心功能失调以及心血管不良事件发生。此外，Batacan等[35]证实，HIIT和MICT对于心血管系统均具有积极作用，其中MICT更有利于心脏健康，HIIT则显著改善血管功能，因此应将两种运动方式有机结合以制定更为有效的健身以及康复运动处方。