多肉植物表皮细胞几种制片方法的比较

王 颖 许 艺 陈秉初 陈文荣

(浙江师范大学化学与生命科学学院 金华 321004)

中学生物学实验中，洋葱因取材方便，制片容易，往往作为植物细胞结构观察的最佳材料，为了使学生认识到植物细胞形状的多样性，通过对植物细胞的观察能够直观地获得更多生物学知识，并增加对植物表皮细胞中气孔器等结构的充分认识，观察除洋葱鳞叶以外的其他植物的表皮细胞能够丰富学生的知识面，提升比较和分析材料的能力。因此，本文选用景天科的玉蝶(Echeveriapumilavar.glauca)为材料研究多肉植物的表皮细胞形态，试图激发学生对生物学的兴趣，加强对生命本质的探索，拓宽学生的视野。同时，比较了直接剥离法、煮沸剥离法、刮片法、过氧乙酸离析法、次氯酸钠离析法、FAA固定法和琼脂糖印迹法等7种方法操作难易程度和制片效果，旨在为多肉植物选择一种适于中学生物学实验课堂的制片方法，将多肉植物表皮细胞的观察引进中学生物学实验课堂中。

1 材料与方法

1.1 材料 实验材料选取常见的多肉植物二年生玉蝶为材料，采摘自内向外第8～9圈玉蝶叶。将采集的玉蝶叶片取中间部分截取1cm×1cm的材料进行制片，制片完成后在光学显微镜下观察并导入DP Controller系统拍照。

1.2 方法 具体如下：

1.2.1 物理法 包含直接剥离法、煮沸剥离法、刮片法：

(1) 直接剥离法 用小镊子直接撕取叶片的下表皮放在载玻片上染色4～5min，盖上盖玻片后镜检。

(2) 煮沸剥离法 将截取的玉蝶叶片在沸水中煮6～8min，取出材料，用小镊子撕取叶片的下表皮放在载玻片上染色4～5min，盖上盖玻片后镜检。

(3) 刮片法 将透明胶带粘在玉蝶叶片材料表皮上，用刀片刮去上表皮及叶肉，留下下表皮，然后将粘有玉蝶下表皮的胶带粘贴在载玻片上，不用盖玻片直接在显微镜下观察。

1.2.2 腐蚀离析法 包含过氧乙酸离析法、次氯酸钠离析法：

(1) 过氧乙酸离析法 将截取的玉蝶叶片浸泡在等量的30%的过氧化氢溶液和醋酸溶液中，在60℃恒温水浴锅中放置3h，漂洗干净后移入盛有蒸馏水的培养皿中，撕取下表皮，放在盖玻片上用1%的番红染色4～5min，盖上盖玻片后镜检。

(2) 次氯酸钠离析法 将截取的玉蝶叶片置于50% NaClO溶液中浸泡至叶片发白后取出，蒸馏水冲洗后撕取下表皮，1%的番红染色4～5min，盖上盖玻片后镜检。

1.2.3 固定法 包含FAA固定法、琼脂糖印迹法：

(1) FAA固定法 量取90mL 50%乙醇，5mL冰醋酸和5mL 37%～40%甲醛溶液，配制成FAA固定液。将截取的玉蝶叶片置于FAA固定液中浸泡24h，蒸馏水冲洗后撕取下表皮，1%的番红染色4～5min，盖上盖玻片后镜检。

(2) 琼脂糖印迹法 将截取的玉蝶叶片置于FAA固定液中24h。称取1.2g琼脂糖溶于80mL ddH2O中，滴入5～6滴1%番红染液使琼脂糖着色，反复煮沸至琼脂糖完全溶解。取1张滤纸，粘上双面胶，将材料吸干水分后展平在双面胶上，放入培养皿中。将冷却至50℃～60℃的琼脂糖倒入培养皿中至淹没材料，静置待其凝固。将培养皿倒置取出琼脂糖凝胶，切取含拓痕的凝胶，将拓痕面朝上放置在载玻片上，镜检。

2 结果与分析

2.1 玉蝶表皮显微形态特征 玉蝶上下表皮仅有一层细胞，包括气孔器和形状不规则的表皮细胞。气孔器属于不等型，由保卫细胞、副卫细胞和气孔共同组成。其中有3个大小不同的副卫细胞围绕着保卫细胞，2个保卫细胞中间存在椭圆形或圆形的气孔。表皮细胞形状比较规则，近椭圆形或近圆形，垂周壁直，弧形或略弯曲，偶尔呈浅波形，细胞之间相互嵌合没有间隙。玉蝶上、下表皮气孔的数目近乎相等，均无表皮毛等附属物。

2.2 三种物理法制备装片质量比较 比较ⓔ图1可知，直接剥离法制备装片质量较高，表皮细胞轮廓清晰，细胞核明显居于细胞中央，能够看到部分微张的气孔，染色均匀度不佳；煮沸剥离法制备装片的表皮细胞轮廓和细胞核清晰度一般，气孔较直接剥离法明显，但染色效果不如直接剥离法；刮片法制备装片清晰度较好，但表皮细胞轮廓较厚，不能观察到细胞核和气孔。

2.3 两种腐蚀离析法制备装片质量比较 两种腐蚀离析法制备的表皮装片均获得较好效果，气孔都比较明显(ⓔ图2)，其中次氯酸钠离析法制备装片的表皮细胞轮廓十分清晰，可观察到细胞核，这也是本研究中唯一能够看到保卫细胞中叶绿体结构的制片方法；而过氧乙酸离析法制备装片表皮细胞遭到破坏，无法辨认细胞核，装片整体清晰度低。由于化学试剂具有腐蚀性、强氧化性等特点，腐蚀离析法的染色效果都一般。

2.4 两种固定法制备装片质量比较 经由固定液处理过的装片都有清晰的表皮细胞轮廓(ⓔ图3)，FAA固定法制备装片染色均匀，气孔明显，表皮细胞的细胞核位于细胞中央，保卫细胞的细胞核贴近细胞壁，是装片清晰度最高的制片方法；琼脂糖印迹法制备装片也能够看到明显的气孔结构，但无法观察到细胞核、叶绿体等其他结构，染色较浅但均匀，建议增加番红溶液的使用量。

2.5 不同制片方法的制片过程比较 从整个制片时长来看，FAA固定法和琼脂糖印迹法耗时最长，腐蚀离析法也都需要较长时间的前期准备，物理法耗时皆不超过20min(表1)。制片操作难度以刮片法最甚，在实验操作时，刀片的力度控制不当都有可能造成叶肉细胞未刮干净或者将需要观察的表皮细胞刮破等情况，此外，由于透明胶带粘贴不当极易产生气泡。琼脂糖印迹法涉及工序比较繁琐，在将含拓痕的凝胶切取下来放置在载玻片上的过程中，凝胶比较柔软，容易因为拉扯而变形，使表皮细胞形状也发生变形，真实性降低。其余5种方法操作难度较低，由于玉蝶表皮细胞仅1层，且容易与叶肉细胞分离，用镊子撕取时成功率较高，难点主要在溶液浸泡时间和染色时间的控制上。另外需要注意的是： 使用离析法制备装片时，若不用蒸馏水洗净叶片表面残留的溶液，容易造成染色不均或染色过浅等情况，尤其在次氯酸钠离析法中此现象更加明显。离析法由于材料具有腐蚀性、易挥发等特点，安全性较低；直接剥离法无需煮沸、刀刮和化学试剂处理，对学生的伤害最小，其余方法安全性一般。

表1 7种制片方法制片过程与装片质量比较

3 结论与讨论

多肉植物与洋葱长方形的表皮细胞相比，形状更加多样，其“花环状”的气孔器也有别于洋葱“肾脏形”的气孔器，同时多肉植物更易获得布满气孔的表皮结构，多样的细胞结构和多肉植物的热门程度能够激起学生对生物学的较高兴趣。除此之外，多肉植物本身表皮容易剥离，叶片数目众多，适量摘取叶片对植物影响较小，且在家庭中普遍种殖，容易获取。比较这7种不同制片方法的制片难度和质量认为： 直接剥离法和FAA固定法比较适用于中学生物学实验课堂，其操作快速而简便，且较其他方法更为安全。综合各方面的考量，FAA固定法制备装片清晰度高，能观察到清晰的表皮细胞轮廓，细胞核以及张开的气孔，虽然其前期处理时间较长，但其时间周期正好为24h，方便教师在前一日将植物材料浸泡在FAA溶液中。由此可见，简易的操作方法和较高的装片质量使得FAA固定法成为适于中学生物学实验课堂中处理玉蝶表皮细胞的最佳方法。但该方法也有其不足之处，即无法观察到保卫细胞中的叶绿体。若课堂需要，可由教师利用次氯酸钠离析法制备装片，既让学生观察到了叶绿体结构，又增加了课堂互动性。若教师时间有限，可采用直接剥离法。因此，用FAA固定法来制备多肉植物表皮装片，具有较高的可行性，值得推广。