甘南藏区牦牛隐性乳房炎病原菌分离及鉴定

王 斐 ，王彩莲 ，郎 侠 ，宋淑珍 ，杨 峰 ，吴建平

（1.甘肃省农业科学院畜草与绿色农业研究所，兰州 730070；2.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，兰州 730050；3.甘肃省农业科学院，兰州 730070）

牦牛（yak）分野生牦牛（Bosmutus）和驯养牦牛（Bos grunniens），是以我国青藏高原为中心分布的特有牛种之一。其中，驯养牦牛作为一种全能家畜，其肉、乳、毛、粪及役力都是当地牧民的生产必需品和重要的生活及经济来源。据统计，甘肃省甘南藏族自治州牦牛共存栏138万头，产奶量高达11.5万t；但由于牦牛饲养分散、大多数牦牛乳为牧民家庭自留用于制作奶茶、酥油、酸奶等食品，商品率较低，商品乳产量仅约2万t［1-2］。

2017年7月，在中国牦牛乳产业发展论坛暨“中国牦牛乳都”授牌仪式上，甘肃省甘南州被中国乳制品工业协会授予“中国牦牛乳都”荣誉称号，“甘南牦牛奶粉”被认证为地理标志保护产品［3］，这意味着牦牛乳业将成为壮大甘南特色产业规模、助推藏区经济转型跨越发展的新引擎。但由于藏区条件所限，牦牛挤奶时仍采用最原始的人工挤奶，挤奶方式粗放，易造成乳房的机械性损伤；同时，挤奶人员对环境、个人、乳房清洁与消毒的忽视，极有可能造成乳房炎在牦牛群中的扩散和二次感染，严重威胁牦牛及牧民的健康与安全。

近年来，国内研究人员分别对西藏自治区林周县［4］、青海省玛沁县［5］与乌兰县［6］及四川省红原县［7］牦牛隐性乳房炎的感染情况进行了调查研究，并分离鉴定了相关病原菌。但尚未有针对甘肃省甘南州牦牛隐性乳房炎发病情况及病原菌的相关调查研究。本研究采集甘肃省甘南州玛曲县、夏河县不同牧场的乳样，从LMT非阴性的乳样中分离纯化细菌，通过16S rDNA方法对细菌的种属进行鉴定，以期为甘南州牦牛隐性乳房炎的预防和治疗提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 PCR扩增仪（SEDIG Thermo Cycler）、电泳仪（GES）为美国威泰克（Wealtec）公司产品；凝胶成像系统（Quantum ST5）为法国维乐贝尔（Vilber）公司产品；离心机（5805DL865663）为德国艾本德（Eppendorf）公司产品；超净工作台（SW-CJ-2FD）为苏州安泰空气技术有限公司产品；高压蒸汽灭菌器（XFS-280MB）为浙江新丰医疗器械有限公司产品；恒温培养箱（SPX-0850）为杭州汇尔仪器设备有限公司产品；冰箱（BCD-215SNGN）为青岛海尔股份有限公司产品。

1.1.2 试剂 兰州奶牛隐性乳房炎诊断液（LMT）由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所提供；营养肉汤、血琼脂营养基础、营养肉汤琼脂、水解酪蛋白琼脂及哥伦比亚血平板为广东环凯微生物科技有限公司产品；细菌DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit）为美国欧米伽（Omega Bio-Tek）公司产品；16S rDNA PCR试剂盒（DNA Marker DL1000）为日本宝日医（TaKaRa）公司产品。

1.2 方法

1.2.1 LMT检测及样本采集 于甘南藏族自治州玛曲县、夏河县夏季牧场内，对无临床乳房炎症状牦牛进行LMT检测。采集前，酒精棉消毒乳头，弃去头两把乳汁，取每头牦牛不同乳区的4份乳样，分别加入LMT检验盘内，取样多于2 mL，并倾斜检验盘约60°，使多余乳样流出；取LMT检验液加入检验盘内，每区2 mL；逆时针晃动检验盘，使待检乳汁与检验液混合均匀，20～30 s后观察是否有胶性凝集物。检出结果为非阴性的乳样冷藏保存，并尽快进行细菌分离培养。

1.2.2 细菌分离纯化 将乳样混合均匀，挑取适量划线接种于血平板上，37℃恒温孵育18～20 h；挑取血平板上的单个菌落分别接种于营养肉汤中，37℃恒温孵育18～20 h；取培养后的细菌进行镜检，若已分离纯化，加入脱脂乳中冷冻保存；若未纯化，则继续划线接种于血平板，重新进行分离纯化，待确定已分离纯化后冷冻保存。

1.2.3 细菌鉴定 采用16S rDNA鉴定方法。使用细菌DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.Bacterial DNA Kit）提取细菌DNA，操作按试剂盒说明书进行；以提取出的细菌DNA作为模板，使用16S rDNA PCR试剂盒对其进行PCR扩增，操作按试剂盒说明书进行；扩增产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并利用凝胶成像系统进行观察分析；将符合测序标准的PCR产物纯化，送北京六合华大基因科技股份有限公司测序；利用NCBI数据库基础片段比对搜索工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）搜索比对测序所得片段，确定细菌种属。

2 结果与分析

2.1 乳样采集及LMT检测

分别于2015年9月、2016年7—8月在甘肃甘南藏族自治州玛曲县、夏河县共检测无临床乳房炎症状牦牛乳区1 181个，分属于11个牦牛群，最少的群9头共36个，最多的群41头共158个。采用LMT检测隐性乳房炎发病情况，结果见表1。由表1可见，试验共检出隐性乳房炎疑似（±）49份、弱阳性（+）59份、阳性（++）13份、强阳性（+++）0份，共121份，检出率10.25%。

表1 甘南藏区牦牛隐性乳房炎LMT诊断结果

2.2 细菌分离及鉴定

在非阴性样品中共分离出细菌236株；使用TaKaRa PCR Kit提取16S rDNA，送北京华大公司测序，测序结果与NCBI BLAST中已发表的基因序列进行比对，鉴定细菌种属，结果见表2。由表2可见，甘南藏区牦牛隐性乳房炎乳样中共分离出的236株细菌属于12属16种细菌，以葡萄球菌属为主，占58.90%，主要包括金黄色葡萄球菌（43.22%）、艾格尼丝葡萄球菌（7.6%）和沃氏葡萄球菌（5.50%）；其次为乳球菌属（20.34%）和埃希氏菌属（13.14%）。

表2 甘南藏区牦牛隐性奶牛乳房炎病原菌分离鉴定结果

3 讨论

牦牛作为青藏高原地区特有的珍稀种质资源之一，是高寒地区牧民重要的奶、毛、肉、役力及燃料来源。其中牦牛乳最具有经济价值，母牛泌乳高峰期一般为产犊当年的8月，挤乳日数和产乳量因地区习俗不同分别为105～180 d、147.6～482.2 kg［8］。牦牛乳风味独特、营养丰富［9］，是当地牧民日常生活的必需品。然而，为条件所限，目前牦牛奶的采集仍主要由藏家主妇操作，卫生条件较差，管理方式粗放，同群母牛通常由同一个人连续手工挤奶等，极易造成牦牛隐性乳房炎的发生。

本研究采用LMT检测牦牛隐性乳房炎，使用期间未发现唐国盛等［10］提出的在使用LMT检测牦牛乳样时出现混合物浓稠、不易晃动等问题。自1983年［11］至今，LMT广泛用于奶牛乳房炎的检测与发病程度的判定［11-12］。但在牦牛隐性乳房炎检测中，近年来大部分研究采用牛乳体细胞计数（SCC）［7，14］及苛性钠凝乳试验法［5-6，15］，LMT 仅见于 1987—1990 年的报道之中［10，16］；封家旺等［4］曾采用与LMT原理相似的加州乳房炎试验（CMT）对牦牛隐性乳房炎进行检测并分离鉴定出了相关病原菌，但未提及检出率。

甘肃省甘南州牦牛隐性乳房炎检出率10.25%，与近年来邻近的青海的乳区阳性检出率11.20%、12.03%结果相似［5-6］，与四川（35.00%）差异较大［7］，这说明牦牛隐性乳房炎发病率与地区有关。而20世纪80年代末期，牦牛隐性乳房炎阳性率仅3.60%～10.00%，乳区阳性率更低，只有 1.57%～2.56%［10，17］，远远低于本研究结果，这可能是由于近40年来藏区原本相对洁净、封闭的环境被打破，人工挤奶及卫生条件较差等原因令细菌经人—畜传播、畜—人—畜大肆传播，导致牦牛隐性乳房炎发病率大幅升高。但由于条件所限，本研究未对LMT、SCC及苛性钠凝乳试验结果进行对比，因此在检出率中将疑似乳样计算在内，对其中分离培养所得病原菌也进行了纯化鉴定。

通过16S rDNA测序比对，牦牛疑似及阳性乳样中共分离出236株细菌，共12属16种，以葡萄球菌属（58.90%）、乳球菌属（20.34%）和埃希氏菌属（13.14%）为主。自1917年以来，研究者们普遍认为无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是导致奶牛乳房炎发生的最重要的病原微生物［17-18］。Östensson 等［18］的研究中亦提及奶牛隐性乳房炎病原菌主要为链球菌属，其次为葡萄球菌属；同时，在李小旭等［7］和封家旺等［4］的研究中，牦牛隐性乳房炎的主要致病菌均为链球菌属，分别占致病菌总数的75.00%和25.00%，包括乳房链球菌、无乳链球菌、停乳链球菌等，其次为葡萄球菌属、埃希氏菌属等。但是，奶牛临床型与非临床型（即隐性）乳房炎病原菌的种类及其发生频率并不完全相同［17，19］。很多研究［20-21］显示，在奶牛隐性乳房炎病例中，葡萄球菌属和埃希氏菌属的检出率远高于链球菌属，其中以金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌为主。考虑到周边环境中病原菌的存在与奶牛乳房炎发病率有直接关系［21］，因此，本研究中未分离出链球菌属细菌，可能与玛曲县、夏河县牧场中链球菌分布较少有关。需进一步对此结果进行论证和研究。

乳房炎是导致泌乳牛产奶量下降最主要的原因之一，而缺乏临床症状的隐性乳房炎不仅导致牦牛产奶量下降，其中携带的病原菌更是威胁挤奶人员及当地牧民身体健康的一大潜在危害。本研究采用LMT对牦牛隐性乳房炎进行判定，试剂和检验盘携带方便，操作过程简单、结果直观；同时采用16S rDNA测序比对分离鉴定病原菌，比此前研究中常采用的生化鉴定结果更为准确，基本不存在误判的可能，为预防牦牛隐性乳房炎的发生、发展和及时的诊断治疗提供了可靠的理论依据。