利用软骨细胞膜片技术体外构建管状软骨组织的实验研究

刘浥 李丹 殷宗琦 周广东 曹谊林

临床上长段气管缺损因无法直接吻合，需要移植气管替代物进行修复。目前常用的有3类气管移植替代物，包括自体组织、异体气管和人工材料，均存在各自的缺点。因此，长段气管缺损的修复一直是临床治疗的难题[1-2]。近年来，组织工程技术的快速发展为解决这一难题提供了新思路[3-4]。Macchiarini等[5]报道了世界首个组织工程气管临床移植案例，但该报道仅就单个病例进行了初步尝试，并无后续的应用报道。因此，要将其真正应用于临床，仍有很多基础科学问题亟待解决[6-7]，其中最重要的是建立长段气管缺损修复后长期存活的大型哺乳动物模型，以及构建成熟的大体积的管状软骨组织。

目前，聚乙酸（PGA）/聚乳酸（PLA）混合材料是在体内外构建组织工程化软骨最常用的支架材料之一。我们之前的研究已经证明，将体外构建的软骨样组织植入裸鼠皮下后，以软骨细胞为种子细胞的复合物能成功再生成熟的软骨样组织[8-9]，而在具有完整免疫能力的大型哺乳动物体内却会引起严重的炎症反应，从而影响软骨组织在大动物体内的构建[10]。为了实现在大型哺乳动物体内构建组织工程软骨，我们尝试选择无支架材料的构建方式[11-13]。我们发现，通过高密度培养，软骨细胞可以在体外构建出较大体积的软骨样复层细胞膜片，膜片的中央部位及周围都形成了均质的软骨陷窝样结构，很好地弥补了PGA/PLA支架材料构建组织工程软骨存在的缺点。由于软骨细胞在bFGF存在时[14]，以及在三维空间中互相接触时均会维持分化现象[15]，该技术对构建软骨的种子细胞代次要求较低，较高代次的软骨细胞也可构建出软骨样组织，大大降低了对软骨供区部位带来的创伤。同时，该方法构建的组织不含支架材料，可以避免非细胞因素在体内引起的炎症反应，是适用于大动物体内软骨再生的方法。本研究进一步改进已有的软骨细胞膜片技术，利用较小体积的羊耳郭软骨组织作为种子细胞，在体外构建与羊气管管径相当的管状软骨样组织，并具备一定的弹性及生物力学强度。现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

10 只山羊，雌雄不限，平均体质量（20.0±3） Kg。每只动物的耳软骨细胞分别用于体外构建2个长段的组织工程管状软骨样组织。依照实验动物保护指南，所有动物都获得了人道主义对待。软骨细胞培养液为含10%胎牛血清、2 ng/mL碱性成纤维细胞生长因子、1%青霉素及链霉素的DMEM培养基。软骨组织培养液为含10%胎牛血清、10 ng/mL转化生长因子、1%青霉素及链霉素的DMEM培养基。

主要实验试剂：10%胎牛血清，0.25%胰蛋白酶（美国Hyclone公司），0.25%Ⅱ型胶原酶（美国Worthington公司），DMEM培养基（美国Gibco公司）。

1.2 原代细胞的获取及扩增

每只山羊取约5.0 cm×6.0 cm大小的耳郭软骨，剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，震荡消化30 min，PBS冲洗3遍，加入0.25%Ⅱ型胶原酶，震荡消化7～8 h[14]。获得的消化液用 100 μm 细胞滤网过滤、离心，去上清液，沉淀的细胞用高糖DMEM重悬。所得细胞按两种方式接种：①原代细胞以1×104cells/cm2的浓度接种在100 mm培养皿上，在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下，用软骨细胞培养液培养，待细胞生长至70%～80%融合时进行传代[16]；②取一个100 mm培养皿作为基础皿，其上接种浓度为4×104cells/cm2的原代细胞，每3天软骨组织培养液换液一次，直至制备软骨细胞膜片。

1.3 细胞膜片技术构建管状软骨样组织

消化、离心、重悬第4代细胞，以8×105cells/cm2的浓度接种于之前留取的基础皿上，以软骨组织培养液培养，隔天换液。体外培养至1～2周时可于培养皿中揭起一100 mm直径的软骨细胞膜片（图1A）。将揭起的膜片包裹于长4 cm、直径1.6 cm的硅胶管外，其外用无菌尼龙线固定（图1B）。继续以软骨组织培养液培养，隔天换液，直至第6周。

1.4 组织学检测

体外培养6周时取样，观察标本大体外观及弹性。 然后，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片（5 μm），HE及藏红-O染色，用于观察组织结构及细胞外基质分泌情况。用免疫组织化学的方法检测Ⅱ型胶原（软骨组织特异性细胞外基质）的表达情况，进一步证明构建组织的软骨表型[17]。

2 结果

2.1 体外构建软骨细胞膜片及组织工程管状软骨的外观

高代次大量扩增后的软骨细胞已失去软骨细胞典型的三角形外观，但以高密度（8×105cells/cm2）接种于基础皿上后可以恢复软骨细胞外观，于体外培养1～2周后即可形成半透明的复层细胞膜片，具有一定的韧性及强度，可于培养皿中被完整揭起。将其包裹于硅胶支撑管外继续体外培养塑形，至6周时取出硅胶支撑管，卷起的膜片已融合为完整的白色半透明的管状组织。该管状组织管径与羊气管实际管径相当，长度达到4 cm，具有一定的生物力学强度，按压后管状软骨管腔被明显压缩，松开后能完全恢复原始管径大小（图1）。

2.2 体外构建组织工程管状软骨的组织学特征

组织学证实，体外构建组织的管壁为连续的软骨样组织，HE染色及藏红-O染色均可见大量软骨细胞外基质和均匀的特异性软骨陷窝形成，未观察到支架材料或其他组织表型。Ⅱ型胶原免疫组化进一步证明了所构建的组织为均匀的软骨组织（图2）。

图1 体外培养构建组织大体观Fig.1 Gross view of constructs after in vitro culture

图2 体外6周组织学染色（左上角小图为完整管腔截面）Fig.2 Histological observation after 6 weeks in vitro culture(The upper left corner represents the complete lumen section)

3 讨论

从理论上讲，组织工程技术可以利用自体细胞预先构建具有特定形状、一定机械强度和真正生物学功能的气管组织，以完全避免其他气管替代物的许多缺点，成为一种真正理想的气管替代物，结合气管修复技术，有望实现长段气管缺损的永久性重建。2013年，我们以组织工程气管成功地修复了兔气管缺损，但该方法并未在完全免疫的大型动物模型中实现。大型哺乳动物长段气管修复失败的原因很多，核心的问题包括再生稳定的大体积管状软骨困难、软骨体内血管化及上皮化不稳定等，而最为首要的问题就是如何构建稳定的大体积管状软骨。

之前的研究是利用软骨细胞＋PGA/PLA支架进行构建，该技术虽已较成熟，但在大动物体内构建仍然存在困难。主要的问题是①对自体软骨细胞的需求量大，供区损伤较大。大量研究证实，软骨细胞在体外扩增过程中容老化，丧失其特征性表型，分泌软骨特异性细胞外基质的能力明显下降[18-19]。而以PGA/PLA支架构建软骨，要求随着支架材料的降解，种子细胞能快速大量地分泌细胞外基质，所以用于接种PGA/PLA支架的软骨细胞需要具备软骨细胞表型及较强的分泌软骨特异性细胞外基质的能力，故通常选择第1代细胞，这就要求获得大量的原代细胞，对供区造成的损伤比较大。②PGA/PLA支架虽然生物相容性好、细胞亲和性高，但其酸性降解产物引起的无菌性炎症会严重影响软骨组织的体内再生[10，16]。在没有生物反应器的情况下，这种方法用于构建与大型哺乳动物气管管径相当的长段软骨组织并不合适，其中央部位软骨形成质量较差，严重影响再生管状软骨的生物力学强度。

本研究利用软骨细胞膜片技术构建大体积管状软骨，针对上述问题进行了改进，以克服目前组织工程管状软骨再生技术中的难点。

如前所述，软骨细胞在体外二维培养体系下扩增培养时，随着代次增高，逐渐老化，丧失软骨细胞特征性表型，Ⅱ型胶原分泌量减少，而代表成纤维细胞特征的Ⅰ型胶原分泌会增多[20-21]。本研究在软骨细胞培养液中加入一定浓度的bFGF，可加快软骨细胞体外扩增的速度，还可减缓软骨细胞成纤维细胞化进程，有助于利用较少的原代软骨细胞扩增出更多代次、更多数量的软骨细胞，减少对供区的损伤。但是，该培养体系下的软骨细胞到第2、3代时仍不可避免地逐渐失去软骨细胞表型，很难在三维支架上分泌大量细胞外基质。而本研究所应用的细胞膜片技术，可使体外扩增的高代次软骨细胞恢复分泌大量软骨细胞外基质的能力。首先，我们的前期研究发现，软骨细胞分泌的基质中含有TGF-β1、IGF-1，能诱导BMSC分化成为软骨细胞，并维持软骨细胞表型[22-23]。本研究在软骨组织培养液中加入TGF-β1，可诱导成纤维细胞化的细胞恢复软骨细胞表型，具备分泌细胞外基质的能力；其次，有文献报道成纤维化的软骨细胞在“细胞堆积”的培养状态下会出现再分化，重新表达软骨细胞特征性表型，并分泌特征性的软骨外基质[24-25]。使用细胞膜片法时，基础皿中的原代细胞软骨表型特征明显，能大量分泌软骨细胞外基质以及TGF-β1，加之培养体系中加入的TGF-β1，共同促进堆积状态下的高代次细胞再分化，恢复分泌细胞外基质的能力。通过分泌的大量细胞外基质的链接，原始堆积状态的细胞团，变为一个有三维立体结构、具备一定力学强度的整体[5]。

利用细胞膜片技术可在小型哺乳动物体内再生管状软骨组织，但至今没有成功用于大型哺乳动物模型的报道。我们的前期研究证实，单纯的软骨细胞膜片在大动物体内可以再生软骨样组织[26]，但包裹塑形的硅胶管一同植入大动物体内后，植入的软骨样组织被大量纤维结缔组织替代，这表明内支撑硅胶管在大动物体内也会引起较强的炎症反应，成为干扰大动物体内管状软骨形成的又一重要因素。那么如果能在体外利用此技术构建出大体积的管状软骨，不仅可以避免硅胶管对于体内软骨再生的影响，也可以弥补之前只能在体内再生片状软骨组织的不足。前期报道中提出的方法是体外培养4周形成细胞膜片[26]，但这时膜片内软骨细胞周围已堆积大量细胞外基质，已形成较为成熟的软骨样组织，经硅胶管塑形后，体外再培养4周的过程中细胞不会再继续大量分泌细胞外基质，所以即使有部分样本能形成管状整体，但不同层次的膜片间连接较疏松，多次按压后很难维持原始的管状。本研究发现，在体外培养1～2周时堆积的细胞就已互相连接紧密，可以自培养皿上完整揭下一层细胞膜片，这时将膜片包裹硅胶管塑形后体外继续培养，细胞继续分泌细胞外基质，可以使多层膜片融合为一个整体，形成具备均匀软骨陷窝的管状组织。本研究构建的组织工程管状软骨，其管径与羊气管实际管径相当，长度达到4 cm，具有一定的生物力学强度，按压后管状软骨管腔被明显压缩，松开后能完全恢复原始管径大小，组织学证实了体外构建的管状组织的管壁为连续的软骨样组织。

总之，本研究提出的体外构建管状软骨的方法，可以缩短体外构建的培养时间，避免支架材料及塑形硅胶管对于软骨再生的影响，为实现大型哺乳动物体内构建大体积的成熟管状软骨提供了很好的技术方法，为最终建立长段气管缺损长期功能重建的大动物模型奠定了技术基础和理论依据。