GC-MS/MS测定啤酒中的两种亚硝胺类化合物

◎ 蒙法双

（北海市食品药品检验所，广西 北海 536000）

N-亚硝胺是一种强致癌性食品污染物[1]，食物、化妆品、啤酒、香烟中均含有亚硝胺类化合物。近年来，人们在饮用水、污水处理消毒后的水体以及直接受工业源污染的水体中也发现了亚硝胺类化合物，亚硝胺类化合物及亚硝化试剂与胺类物质等前体物质均是恶性肿瘤流行病学和病因学的重要内容[2]。亚硝胺类化合物因其潜在的致毒致癌性而成为当前的一大研究热点[3]。本文探讨啤酒中N-二甲基亚硝胺和N-亚硝基吡咯烷快速测定的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

气相色谱-质谱联用仪（Agilent GC7890B/MS7000C，美国Agilent公司），自带CTC自动进样器；Panasonic MDF-U5412医用低温箱（-40 ℃，日本松下公司）；XA205DU精密电子天平（梅特勒-托利多上海公司）；3-18K高速台式冷冻离心机（德国sigma公司）；5510E-DTH超声波清洗器（美国BRANSONIC公司）；Si-T256涡旋混合器（美国Scientific Industries公司）；8200半自动凯氏定氮蒸馏仪（丹麦FOSS公司）；R-215平行蒸发旋转蒸发仪（瑞士Buchi公司）。

1.2 试剂

N-二甲基亚硝胺（NDMA，浓度 100 μg/mL，Accustandard Inc.）、N-亚硝基吡咯烷（NPYR，浓度100μg/mL，Accustandard Inc.）；乙腈（色谱纯，Fisher Chemical公司）、二氯甲烷（色谱纯，Fisher Chemical公司）、氯化钠（优级纯，天津光复公司）、无水硫酸钠（分析纯，广东华大公司）、纯生啤酒（市售），水为去离子水。

1.3 实验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：Agilent122-7032DB-WAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。柱温升温程序：起始温度40 ℃，保持1 min；以10 ℃/min升温至110 ℃，再以15 ℃/min升温至200 ℃，再以40 ℃/min 升温至250 ℃，保持3.75 min；进样口温度：250 ℃，隔垫吹扫流量：3 mL/min，进样模式：不分流进样，进样量：1.0 μL；载气：He（纯度＞99.999%），进样流速1.2 mL/min。质谱条件：离子源温度230 ℃；连接管线温度250 ℃；电离方式为EI正离子模式；电子能量为70 eV；电子倍增器电压为2000 V；选择离子扫描（MRM）条件：m/z：74.0→44.1，42.1（NDMA）；100.0→55.1，70.0（NPYR）；溶剂延迟5 min（见表1）。

表1 两种挥发性N-亚硝胺的质谱分析参数表

1.3.2 标准溶液的配制

标准使用液：分别吸取N-二甲基亚硝胺、N-亚硝基吡咯烷标准溶液0.5 mL，并置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀（此溶液为5 μg/mL）。

混合标准溶液：分别吸取N-二甲基亚硝胺标准使用液、N-亚硝基吡咯烷标准使用液各1.0 mL，并置于50 mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀（此溶液为 100 μg/L）。

标准工作溶液曲线的制备：分别吸取0.1、0.5、1.0、2.0 mL和5.0 mL混合标准溶液，并置于10 mL容量瓶中，配制成浓度为1.0、5.0、10、20 μg/L和50 μg/L的溶液，供气相色谱-质谱仪测定。

1.3.3 样品的制备与处理

称取均质（尽量将样品冷藏后均质）试样10 g（精确到0.01 g）于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈，涡旋，在冰箱中冷冻30 min，加入2个陶瓷均质子和Bond Elut QuEChERS萃取盐，迅速振荡30 s，10000 r/min在0 ℃低温离心10 min。取上清液6 mL加入到15 mL Bond Elut QuEChERS基质分散净化管中，涡旋1 min，10000 r/min在0℃低温离心10 min，取上清液过0.2 μm滤膜，GC-MS/MS检测。

1.3.4 空白试验

除不加试样外，其他操作与1.3.3同样处理。

2 结果与分析

2.1 样品制备的选择

2.1.1 样品提取方法的优化

本实验参考不同的文献[4-12]，分别以水蒸气蒸馏法[7]、超声震荡提取法[5]和冷冻萃取盐提取法对样品进行前处理，比较3种处理下的结果，表明冷冻萃取盐法比前两法提取更完全，回收率更高，操作便捷，因此选择了冷冻萃取盐法提取样品中的N-亚硝胺类物质。

2.1.2 水蒸气蒸馏法的优化

本实验还考察了定氮仪水蒸气蒸馏法样品和试剂4倍、10倍减量来提取操作，根据方法的检出限0.3 μg/kg的量来加入，结果无法检出峰或被样品干扰；样品回收率也均达不到冷冻萃取盐提取方法的效果。

2.2 柱温升温速率的优化

亚硝胺的分子质量小，沸点低，出峰快，溶剂峰容易干扰，为达到最佳分离效果，需要优化柱温升温速率。选择柱温起始温度为40 ℃，分别比较升温速率为5 ℃/min、10 ℃/min和15 ℃/min的分离效果，实验结果显示：当升温速率为5℃/min时，溶剂峰与N-二甲基亚硝胺的色谱峰均无法明确分出；当升温速率为10 ℃/min时，能够有效分离，而继续升温速率为15 ℃/min时，样品杂质峰与N-二甲基亚硝胺色谱峰的分离效果没有明显改善，因此选择升温速率为10 ℃/min。当柱温升高到110 ℃时，N-二甲基亚硝胺的色谱峰已出峰；在第二梯度将升温速率提高为15 ℃/min时，才能有效的分离溶剂峰与N-亚硝基吡咯烷。因此，最终选择柱温为起始温度40 ℃，保持1 min，以10 ℃/min升温至110 ℃后，以15 ℃/min升温至200 ℃，再以40 ℃/min 升温至250 ℃，保持3.75 min。按照上述优化条件，选择电子轰击电离源（EI），正离子模式，电子能量为70 eV，采集模式为MRM，对两种N-亚硝胺混合标样分析，得到标准品的气相色谱-质谱总离子流图如图1所示。

图1 两种N-亚硝胺的色谱图

2.3 方法的线性、检出限、回收率和精密度

2.3.1 方法的线性、检出限

精密吸取混合标准溶液0.1、0.5、1.0、2.0 mL和5.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释并定容，摇匀，配制成浓度为1.0、5.0、10、20 μg/L和50 μg/L的溶液，涡旋混匀30 s，经0.22 μm微孔滤膜过滤，取滤液按1.3.1中所述的色谱条件进行测定，并记录峰面积。利用定量离子峰面积绘制标准曲线。每个质量浓度的样品测定3次，以目标物的峰面积Y对其质量浓度X进行回归分析，得到各N-亚硝胺的线性方程、相关系数和线性范围，见表2。

表2 两种亚硝胺的线性范围、回归方程和检出限表

2.3.2 回收率和精密度

将低、中、高不同质量浓度水平的N-亚硝胺标准溶液加入到啤酒阴性样品中，再按照1.3.3处理和1.3.1所述条件进行上机检测，每个样品平行测定6次，精密度和回收率结果见表3。由表3可知，本方法的相对标准偏差（RSD)小于8%，回收率为80%～109%，表明本方法精密度和准确度均较高。

表3 样品加标回收试验结果表

2.4 样品测定分析

取5批市售啤酒6批按1.3项实验方法分别测定N-二甲基亚硝胺、N-亚硝基吡咯烷的含量，每个样品测定3次，取平均值，结果见表4。

3 结论

本实验建立的气相色谱-质谱联用法快速测定啤酒中两种挥发性N-亚硝胺含量的分析方法，通过比较不同提取方法，优化了实验分析条件。GB 5009.26-2016前处理简便快捷，灵敏度高，重现性良好。适用于高通量分析检测N-亚硝胺类化合物，是一种易于操作，灵敏度高的测定方法。但目前GB 2762-2017中只有肉与肉制品和水产与水产制品的N-二甲基亚硝胺限量指标，并没有啤酒的限量指标，更没有N-亚硝基吡咯烷的任何限量指标。