五味子酸性多糖分级产物对小鼠急性酒精性肝损伤的改善作用

潘 炎,陶 雪,梁 爽,苑荣爽,李 贺,孙靖辉,陈建光,王春梅

(北华大学药学院药理教研室,吉林吉林 132013)

五味子(Schisandrachinensis)为木兰科植物,其干燥成熟的果实是著名滋补性中药,具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心等功效。我国五味子南北均有分布,即南五味子(华中五味子)和北五味子(五味子)[1-4]。其中北五味子色黑,有效成分含量丰富,是长白山道地药材。五味子作为我国传统保肝药物,临床常用于复方护肝制剂中,但有关五味子保肝作用的物质基础一直没有明确定论[5-8]。

五味子的主要活性成分有木脂素类、多糖及挥发油等。其中多糖成分大约占五味子的10%左右[9-11]。近年的研究表明五味子多糖具有抗氧化、镇咳、护肝、抗炎等多种功效,且安全性较好,日益受到业界的关注[12-15]。然而由于多糖的结构复杂,多数研究都以五味子粗多糖为研究对象,课题组的研究也表明五味子粗多糖对CCl4、高脂饮食等诱导的肝损伤具有良好的保护作用[16-17],然而有关其进一步的分级产物是否具有护肝作用尚未见报道。

本研究采用现代工艺分离纯化五味子酸性多糖分级产物,建立小鼠急性酒精性肝损伤模型,观察五味子酸性多糖分级产物对急性酒精性肝损伤的保护作用,为其进一步开发利用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

五味子 吉林省集安五味子种植基地;葡萄糖标准品 北京化学试剂公司;苯酚 天津天泰精细化学品有限公司;浓硫酸、乙醇 北京化工厂;间羟基联苯、氨基磺酸 Sigma;雄性ICR小鼠 50只,体重19～21 g,由长春亿斯实验动物技术有限公司提供,动物检测合格证号:SCXK(吉)2016-0003;超氧化物歧化酶(SOD)测试试剂盒、甘油三酯(TG)测试试剂盒、丙二醛(MDA)测试试剂盒、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)测试试剂盒、血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)测试试剂盒 南京建成生物工程公司;BCA蛋白浓度测定试剂盒 碧云天生物技术公司;DEAE-纤维素 上海恒信化学试剂有限公司。

Infinite M200TECAN型酶标仪 瑞士TECAN集团公司;S10型手提式高速分散器 宁波新生生物科技股份有限公司;5418R型小型台式冷冻离心机 德国Eppendorf公司;721B型分光光度计 上海第三分析仪器厂;DP71型光学显微镜 日本Olympus公司;Thermo ODS HYPERSIL高效液相色谱柱 日本岛津;Shimadzu HPLC系统 日本Shimadzu公司。

1.2 实验方法

1.2.1 五味子酸性多糖的提取、分离与纯化 经预实验确定五味子多糖的最佳提取工艺条件,具体为五味子果实1.0 kg加入10倍蒸馏水浸泡24 h,经100 ℃热水煮提2次(3 h+2 h),将提取液经80 ℃浓缩至2 L,离心(4500 r/min,15 min),弃去沉淀。向上清液加入95%乙醇,乙醇终浓度为75%(用酒精计测定),沉淀24 h,离心(4500 r/min,15 min),收集沉淀。将沉淀依次用95%乙醇和无水乙醇洗涤,水浴蒸干,得粉末状五味子多糖85.5 g,得率为8.55%(多糖得率(%)=多糖质量/五味子样品质量×100)。制备0.5%的多糖水溶液,上平衡好的DEAE-纤维素离子交换层析柱(20 mL,Cl-型),首先用蒸馏水洗脱,去除中性多糖,再用0.1、0.2、0.3和0.5 mol/L NaCl溶液进行线性梯度洗脱,流速1 mL/min,分别收集洗脱液,加热浓缩后干燥(80 ℃),得五味子酸性多糖,得率约为2.8%。取5 mg五味子酸性糖,溶于1 mL蒸馏水中,再次用0.1、0.2、0.3和0.5 mol/L NaCl水溶液进行线性梯度洗脱,分别收集洗脱液,通过离子交换柱层析,可制备出五味子酸性糖分级产物。酸性糖分级产物得率(%)=分级产物质量/五味子酸性多糖样品质量×100。

1.2.2 五味子酸性多糖的化学组成分析 采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[18],间羟基联苯法测定糖醛酸含量[19],考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[20],采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化[21]和高效液相色谱法(洗脱流速为1.0 mL/min,色谱柱为Thermo ODS HYPERSIL色谱柱4.6 mm×150 mm,洗脱液为81.8%的PBS溶液0.1 mol/L,pH7.0和18.2%的乙腈v/v,检测温度为35 ℃,检测波长为245 nm)分析五味子多糖各级分的单糖组成。

1.2.3 酒精诱导急性肝损伤动物模型的建立及处理 将50只小鼠按体重随机分组,分别为正常对照组、模型对照组、SCAP-2各剂量组(5、10、20 mg/kg·bw)每组10只。常规饲料喂养,自由饮水。SCAP-2各剂量组给予SCAP-2进行灌胃,正常对照组和模型组给予同体积蒸馏水灌胃,每日一次,连续15 d。末次给药1 h后,模型组及SCAP-2各剂量组小鼠给予灌胃50%乙醇(12 mL/kg·bw),正常对照组小鼠给予同体积生理盐水灌胃,禁食不禁水。16 h后,各组小鼠摘取眼球取血,3500 r/min,4 ℃离心,分离血清,装入1.5 mL离心管内,-80 ℃冻存。断髓处死小鼠,迅速剖腹取出肝脏于冷的生理盐水中,滤纸吸干。观察整体形态以及表面光泽,取每只小鼠相同部位的肝小叶组织,分为两份,一份置于10%中性福尔马林溶液中固定待用,一份制备匀浆以用于肝组织相关指标检测。

1.2.4 ALT和AST水平的检测 采用酶法测定血清中AST和ALT水平,具体方法参照试剂盒说明书。

1.2.5 MDA、TG含量和SOD活性的检测 剪取一定量的肝组织加入9倍量的生理盐水,在冰水浴中用匀浆机制成组织匀浆,2500 r/min离心15 min,取上清液,-80 ℃冻存。分别采用TBA法和WST-1法测定肝组织和血清中MDA含量及SOD活性,采用GPO-PAP酶法测定肝组织中TG含量,BCA试剂盒检测蛋白浓度,具体方法参照试剂盒说明书。

1.2.6 病理学检查 剪下肝左叶置于10%福尔马林溶液固定,石蜡包埋切片常规 HE 染色。在光镜下观察肝脏病理学变化。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 五味子酸性多糖的化学组成分析

经过离子交换柱层析进行洗脱分级制备得到五味子酸性糖SCAP-1、SCAP-2、SCAP-3和SCAP-4。如表1所示,五味子酸性多糖SCAP-2的得率和糖醛酸含量最高,所以后续的实验选用SCAP-2级分。

表1 五味子酸性多糖的化学组成分析Table 1 Analysis of chemical composition of Schisandra chinensis acidic polysaccharides

2.2 SCAP-2对小鼠血清中ALT和AST水平的影响

AST和ALT是肝细胞内的主要功能酶,是肝细胞损害的敏感性指标,故小鼠血中AST和ALT水平的高低可判断其肝细胞损伤的程度[22]。由表2可知,与正常对照组比较,模型组小鼠血清AST和ALT水平均极显著增高(p<0.01),说明小鼠一次性灌胃50%乙醇可引起肝细胞损伤;与模型组相比,不同剂量的SCAP-2可使小鼠血清中ALT和AST水平均有所下降,其中低剂量的SCAP-2对小鼠血清中ALT和AST水平的下降作用不显著,中剂量的SCAP-2可显著降低小鼠血清中的ALT水平(p<0.05),但对AST水平的降低效果不显著,而高剂量的SCAP-2可显著降低小鼠血清中的ALT和AST水平(p<0.05)。由此可知,适当剂量的SCAP-2对酒精诱导的小鼠肝损伤具有一定的保护作用。

表2 SCAP-2对小鼠血清中ALT和AST水平的影响(n=10)Table 2 Effects of SCAP-2 on ALT and AST levels in the serum of mice(n=10)

2.3 SCAP-2对小鼠血清中SOD活性和MDA含量的影响

酒精引起肝损伤的主要机制为氧化应激损伤。MDA是生物体内脂质过氧化反应的最终代谢产物,可破坏细胞膜结构,导致细胞肿胀坏死,其含量可以反映过氧化损伤和细胞受损的程度。而SOD是生物体内重要的抗氧化酶,能有效清除代谢过程中产生的氧自由基,减轻氧化应激损伤,测定其活性可间接反映机体的抗氧化能力[23]。由表3可知,与正常对照组比较,模型组小鼠血清中SOD活性显著降低(p<0.05)、MDA含量显著升高(p<0.05),表明酒精致肝损伤小鼠机体抗氧化能力降低,氧化应激增强;与模型组比较,除SCAP-2低剂量组外,SCAP-2的其他两个剂量组均可显著升高SOD含量(p<0.05),显著降低MDA含量(p<0.05),其中,SCAP-2高剂量组对小鼠血清SOD水平的升高作用极显著(p<0.01)。由此表明,SCAP-2可能通过提高机体抗氧化能力改善酒精诱导的小鼠肝损伤。

表3 SCAP-2对小鼠血清中MDA含量和SOD活性的影响(n=10)Table 3 Effects of SCAP-2 on MDA content and SOD activity in the serum of mice(n=10)

2.4 SCAP-2对小鼠肝组织中MDA、TG含量和SOD活性的影响

大量摄入酒精,不仅可以引起肝脏氧化应激损伤,还可以使三羧酸循环和脂肪酸氧化受阻从而影响脂肪代谢,致使甘油三酯(TG)在肝细胞内沉积,大量蓄积可能导致病变[24]。本研究进一步检测了肝组织中MDA和TG含量和SOD活性。由表4可知,与正常对照组比较,模型组小鼠肝组织中MDA和TG含量显著增高(p<0.05或p<0.01),SOD活性显著降低(p<0.05),提示模型建立成功;与模型组比较,SCAP-2低、中剂量组可显著升高小鼠肝组织的SOD水平(p<0.05或p<0.01),但对小鼠肝组织中MDA和TG含量影响不显著;SCAP-2高剂量组可极显著升高小鼠肝组织的SOD水平(p<0.01),降低TG含量(p<0.01),显著降低小鼠肝组织中MDA含量(p<0.05)。由此可知,适量剂量的SCAP-2可以使小鼠肝脏的氧化应激状况和脂肪代谢得以改善。

表4 SCAP-2对小鼠肝组织中MDA、TG含量和SOD活性的影响(n=10)Table 4 Effects of SCAP-2 on MDA and TG contents and SOD activity in the liver tissue of mice(n=10)

2.5 SCAP-2对小鼠肝组织病理形态的影响

由图1可知,正常对照组小鼠的肝细胞排列整齐,大小正常,细胞核大而圆,核质均匀分布,无水肿、变性、坏死、无炎症细胞浸润等现象。模型组小鼠肝组织中肝索排列不规则,整个肝细胞胞浆疏松化,表明小鼠急性酒精性肝损伤模型建立成功。SCAP-2各剂量组小鼠肝细胞排列整齐,整个肝细胞胞浆疏松化明显减轻,且以高剂量组明显,表明SCAP-2可以改善酒精诱导的小鼠肝脏病理学变化。

3 讨论与结论

多糖是五味子的主要活性成分之一,与木脂素类成分相比,具有含量高、毒性低等优点,极具开发价值。本研究采用柱层析法,经过离子交换柱层析进行洗脱分级制备得到五味子酸性多糖SCAP-1、SCAP-2、SCAP-3和SCAP-4。进一步,观察了SCAP-2对酒精性肝损伤的影响,结果表明SCAP-2可降低酒精诱导肝损伤模型小鼠血清中AST和ALT水平,改善肝细胞病理形态学变化,对急性酒精性肝损伤具有一定的保护作用。

肝脏是机体乙醇代谢的主要场所,在乙醇脱氢酶作用下生成乙醛,进而转化为乙酸,进入体循环。乙醇的大量脱氢氧化导致三羧酸循环障碍和脂肪酸氧化减弱而影响脂肪代谢,使TG在肝细胞内沉积,同时过量酒精摄入引起肝细胞发生脂质过氧化,并产生大量的氧自由基(ROS),过量的ROS造成氧化应激、最终促进脂质氧化过程。因此,氧化损伤是酒精诱导肝损伤的主要机制之一。研究报道五味子多糖不仅可以清除二苯代苦味肼基自由基(DPPH·)、超氧阴离子自由基、羟自由基等,而且可以降低四氯化碳(CCl4)中毒小鼠肝组织丙二醛含量,提高SOD活性和GSH含量,体内体外均具有显著的抗氧化作用[25-26]。本研究结果也显示SCAP-2能够降低小鼠血清和肝组织中MDA含量,增加SOD活性,提示SCAP-2对酒精性肝损伤的保护作用可能与其抗氧化作用有关。

综上所述,五味子酸性多糖的分级产物SCAP-2能降低急性酒精性肝损伤小鼠的血清转氨酶水平,改善肝脏病理学变化,对酒精诱导的急性肝损伤具有显著的保护作用,且其作用机制可能与抗自由基脂质过氧化反应及改善肝脏脂质代谢有关,这些结果为五味子多糖的进一步开发利用提供了理论依据。