蔓菁对小鼠肠道菌群的影响

王文宁,张晓峰,韩 萍,*,于 斐,曹 阳

(1.郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室,河南郑州 450001;2.郑州大学公共卫生学院卫生化学教研室,河南郑州 450001)

蔓菁(BrassicarapaL.),又名芜菁,属十字花科芸薹属芸薹种芜菁亚种,为两年生草本植物。蔓菁适应性强,易于栽培,从东汉时期便在我国普遍种植[1],目前产地遍及西藏、新疆、晋南等地。蔓菁是我国常见的食用蔬菜之一,其肉质根既可食用[2],又可药用,有藏族、维吾尔族、普米族药用历史[3]。

研究表明,蔓菁富含多糖、氨基酸、纤维素、黄酮等成分[1],其提取物具有多种生物学活性。王宇等[4]、杨永东[5]证实蔓菁多糖可减少血清和脑组织中丙二醛含量,提高超氧化物歧化酶的活性,具有抗缺氧活性。杨永东等[6]、马合木提等[7]通过体外实验发现,蔓菁子多糖可清除自由基达到抗氧化能力。安熙强等[8]发现蔓菁粉和蔓菁膏对小鼠辐射后损伤具有一定的防护、修复能力。陈湘宏等[9]发现蔓菁挥发油可显著降低高脂高糖小鼠血糖。此外蔓菁提取物还具有提高免疫力[10]、抑制肿瘤生长[11]等活性。目前对于蔓菁对肠道功能及代谢的影响少有文献报道。

本研究采用蔓菁粉饲喂小鼠,检测小鼠粪样中肠道菌群数量和短链脂肪酸(Short Chain Fatty Acids,SCFAs)的含量,探讨蔓菁对肠道菌群的影响,为调节肠道功能新产品的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蔓菁样品 新乡市凤泉区,经郑州大学药学院的潘成学副教授鉴定为蔓菁块根;SPF级近交系BalB/C雄性小鼠 48只,6～8 周,体重(20±2) g,河南省实验动物中心(许可证号:SCXK(豫)2015-0004);基础饲料 河南省实验动物中心(许可证号:SCXK(豫)2015-0005);LBS琼脂培养基、BBL琼脂培养基、VRBDA培养基、肠球菌琼脂培养基、TSC琼脂培养基、卵黄乳液 BR级,青岛海博生物技术有限公司;D-环丝氨酸、L-半胱氨酸 BR级,上海源叶生物科技有限公司。

观察室 室温18～22 ℃,相对湿度45%～55%,通风条件良好,环境相对安静,郑州大学公共卫生学院实验动物观察室(许可证号:SCXK(豫)2012-0007);DG250型厌氧工作站 英国DWS公司;PNP9082型恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;7890B-5977A型气质联用仪 安捷伦科技有限公司;SW-CJ型超净工作台 苏净安泰空气技术有限公司;HVE-50型高压灭菌锅 日本Hirayama公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 参照王宇等[5]的实验方法并稍作改进。将实验小鼠按体重随机分为4 组,即对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组12只,对照组饲喂标准基础饲料,低、中、高剂量组分别饲喂不同剂量蔓菁粉(1、2、4 g/kg·BW·d),连续干预14 d。

1.2.2 复合饲料配制及干预方法 蔓菁块根洗净,去皮,切成1 mm薄片,50 ℃干燥12 h,粉碎,过60 目筛,放于干燥器备用。将蔓菁粉与基础饲料以1∶2的比例混合,加适量去离子水,后压缩成棒状,制成复合饲料。干预组每日同一时间先给予复合饲料,吃完后再根据小鼠食量添加基础饲料。每周称量一次小鼠体重,根据体重调整干预剂量。

1.2.3 粪样采集 分别在干预第0 d(饲喂前)、第7、14 d称重并无菌收集约0.03 g新鲜粪样于10 mL灭菌离心管中,加入5 mL灭菌稀释液,振荡混匀,制成样本均质液,待测。

1.2.4 肠道菌群计数 参照《保健食品检验与评价技术规范》[12]。

1.2.4.1 灭菌稀释液和培养基的配制 灭菌稀释液:吐温80 1 mL和酵母粉0.5 g溶解在1000 mL去离子水中,调节pH7.0～7.2,115 ℃高压灭菌20 min,冷却到50 ℃左右,无菌加入经滤膜除菌的0.5% L-半胱氨酸;LBS琼脂培养基:取培养基84 g,加吐温80 1 mL,冰乙酸1.3 mL,溶解在1000 mL去离子水中,调整pH6.0～6.5,118 ℃高压灭菌15 min;BBL琼脂培养基:取培养基70 g,加吐温80 1 mL,溶解在1000 mL去离子水中,调整pH7.0,115 ℃高压灭菌20 min;VRBDA培养基:取培养基39.5 g,溶解在1000 mL去离子水中,调整pH7.1,121 ℃高压灭菌15 min;肠球菌琼脂培养基:取培养基56.25 g,溶解在1000 mL去离子水中,调整pH8.0,121 ℃高压灭菌15 min;TSC琼脂培养基:取培养基47 g,溶解在1000 mL去离子水中,调整pH7.0～7.2,115 ℃高压灭菌20 min,冷却到50 ℃左右,无菌加入经滤膜除菌的0.5% D-环丝氨酸20 mL和50%卵黄溶液20 mL。

1.2.4.2 平板计数方法 采用平板计数法计数肠道菌群。10 倍梯度稀释样本均质液,接种于相应培养基上,双歧杆菌采用BBL琼脂培养基、产气荚膜梭菌采用TSC琼脂培养基厌氧培养,乳酸杆菌采用LBS琼脂培养基、肠杆菌采用VRBDA培养基、肠球菌采用肠球菌琼脂培养基正常培养,分别计数5种菌。

1.2.5 SCFAs含量的测定 取粪样均质液2 mL于5 mL离心管中,4000 r/min离心10 min后,取上清1 mL于1.5 mL离心管中,加入0.75 mol/L盐酸5 μL,振荡混匀,静置10 min,13000 r/min离心5 min,取上清1 mL过0.45 μm滤膜于进样瓶中。样品保存在4 ℃冰箱中(不超过3 d),待测。

采用气相色谱-质谱联用法检测粪样中乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸的含量。色谱条件为:色谱柱:Agilent DB-WAX石英毛细管柱(30 m×250 μm,0.25 μm);升温程序:柱温的起始温度为40 ℃,维持1 min,以40 ℃/min的速度将温度上升到60 ℃,再以10 ℃/min的速度将温度上升到80 ℃,接着以10 ℃/min的速度将温度上升到110 ℃,最后以40 ℃/min的速度将温度上升到190 ℃,维持2 min;以氦气为载气,气流流速为1 mL/min,不分流;进样体积为0.5 μL,进样口温度为200 ℃。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 蔓菁对小鼠体重的影响

不同剂量组小鼠体重随时间变化如表1所示。

表1 不同剂量组不同时间小鼠体重的变化(g,n=12)Table 1 Body weight of mice in different dose groups at different times

由表1可知,在干预第0、7、14 d,不同组组间小鼠体重变化差异不显著,即摄入蔓菁对小鼠体重无不良影响。

2.2 蔓菁对小鼠肠道菌群数量的影响

2.2.1 蔓菁对小鼠粪样中乳酸杆菌和双歧杆菌数量的影响 不同剂量组不同时间小鼠粪样中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量如表2所示。

由表2可知,与第0 d相比,饲喂第7 d,中剂量组小鼠粪样中乳酸杆菌数量显著增加(p<0.05),中、高剂量组小鼠粪样中双歧杆菌数量显著增加(p<0.05),表明相对于乳酸杆菌,蔓菁对小鼠粪样中双歧杆菌数量影响较为明显;饲喂第14 d,各剂量组小鼠粪样中乳酸杆菌和双歧杆菌数量均显著增加(p<0.01),表明蔓菁可促进乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖。相同时间内,单一菌种不同剂量组比较,高剂量组乳酸杆菌数量增加最为明显,中剂量组双歧杆菌数量增加最为明显,推测乳酸杆菌和双歧杆菌的增殖与蔓菁的摄入量有关,可能存在一个最适范围。单一菌种同剂量组不同时间比较,第14 d细菌数量增加最为明显(p<0.01),表明蔓菁发挥效应需要一定时间累积。

表2 不同剂量组小鼠粪样中乳酸杆菌和双歧杆菌的数量(lg CFU/g,n=12)Table 2 The numbers of Lactobacillus and Bifidobacterium in the fecal samples of mice in different dose groups

2.2.2 蔓菁对小鼠粪样中肠杆菌和肠球菌数量的影响 不同剂量组不同时间小鼠粪样中肠杆菌和肠球菌的数量如表3所示。

表3 不同剂量组小鼠粪样中肠杆菌和肠球菌的数量(lg CFU/g,n=12)Table 3 The numbers of Enterobacteriaceae and Enterococcus in the fecal samples of mice in different dose groups

由表3可知,与第0 d相比,饲喂第7 d,各剂量组小鼠粪样中肠杆菌数量均无明显变化(p>0.05),肠球菌数量均明显减少,且中剂量组肠球菌数量减少最明显,表明相对于肠杆菌,蔓菁对肠球菌的影响较为明显;饲喂第14 d,各剂量组小鼠粪样中肠杆菌数量均增加(p<0.05),肠球菌数量均明显减少(p<0.05)。相同时间内,单一菌种不同剂量组比较,中剂量组肠杆菌和肠球菌变化最明显(p<0.05),表明蔓菁可促进肠杆菌的增殖,抑制肠球菌的增殖,且蔓菁粉剂量为2 g/kg·BW·d时,作用效果最佳。

2.2.3 蔓菁对小鼠粪样中产气荚膜梭菌数量的影响 不同剂量组不同时间小鼠粪样中产气荚膜梭菌的数量如表4所示。

表4 不同剂量组小鼠粪样中产气荚膜梭菌的数量(lg CFU/g,n=12)Table 4 The number of Clostridium perfringens in the fecal samples of mice in different dose groups

由表4可知,与第0 d相比,饲喂第7 d,各剂量组小鼠粪样中产气荚膜梭菌数量无明显变化(p>0.05);饲喂第14 d,各剂量组小鼠粪样中产气荚膜梭菌数量均明显减少(p<0.05),表明蔓菁可有效抑制产气荚膜梭菌的增殖,且发挥效应需要一定时间累积。与对照组相比,饲喂第14 d,各剂量组小鼠粪样中产气荚膜梭菌数量均明显减少(p<0.05),且中剂量组减少最为明显(p<0.05),表明蔓菁粉剂量为2 g/kg·BW·d时,作用效果最佳。

2.3 蔓菁对小鼠粪样中SCFAs含量的影响

2.3.1 蔓菁对小鼠粪样中乙酸、丙酸含量的影响 不同剂量组不同时间小鼠粪样中乙酸、丙酸的含量如表5所示。

表5 不同剂量组小鼠粪样中乙酸、丙酸的含量(mmol/100 g,n=12)Table 5 The composition of acetic acid,propionic acid in the fecal samples of mice in different dose groups

由表5可知,与第0 d相比,饲喂第7 d,各剂量组乙酸、丙酸含量明显增加(p<0.05);与对照组相比,在第7 d时,中、高剂量组乙酸含量明显增加(p<0.05),低剂量组乙酸含量无明显变化(p>0.05),各剂量组丙酸含量无明显变化(p>0.05),表明相对于丙酸,乙酸更易受蔓菁干预影响。饲喂第14 d,各剂量组乙酸、丙酸含量均明显增加(p<0.05),单一酸不同剂量组比较,高剂量组增加最明显。由此表明,蔓菁可促进乙酸和丙酸的生成,乙酸含量明显高于丙酸含量,且在蔓菁粉剂量为4 g/kg·BW·d时,作用效果最佳。

2.3.2 蔓菁对小鼠粪样中正丁酸、异丁酸含量的影响 不同剂量组不同时间小鼠粪样中正丁酸、异丁酸的含量如表6所示。

表6 不同剂量组小鼠粪样中正丁酸、异丁酸的含量(mmol/100 g,n=12)Table 6 The composition of n-butyric acid,isobutyric acid in the fecal samples of mice in different dose groups

由表6可知,与第0 d相比,饲喂第7 d,各剂量组正丁酸的含量均明显增加(p<0.05),各剂量组异丁酸含量无明显变化(p>0.05),表明相对于异丁酸,正丁酸更易受蔓菁干预影响;与对照组相比,饲喂第7 d时,低、高剂量组正丁酸含量明显增加(p<0.05),中剂量组正丁酸含量无明显变化(p>0.05),高剂量组异丁酸含量明显增加(p<0.05),低、中剂量组异丁酸含量无明显变化(p>0.05),表明正丁酸、异丁酸的产生受蔓菁干预剂量的影响。饲喂第14 d,各剂量组正丁酸、异丁酸含量均明显增加(p<0.05),且高剂量组增加最明显,表明蔓菁可促进丁酸的生成,且在蔓菁粉剂量为4 g/kg·BW·d时,作用效果最佳。单一酸同剂量组不同时间比较,第14 d丁酸含量增加最为明显(p<0.05),表明蔓菁发挥效应需要一定时间累积。

3 讨论

作为维持肠道稳定的重要因素,肠道菌群与机体健康之间的关系越来越得到人们的重视[13]。研究发现,肠道菌群的失调与肥胖、肝脏疾病、糖尿病、自身免疫性疾病等疾病密切相关[14-16],而肠道益生菌双歧杆菌、乳酸杆菌的补充可缓解肠道紊乱[17-18],相对于药物或生物制剂调节肠道菌群,饮食结构的改变和膳食营养成为人们关注的热门[19]。本研究在小鼠日常饮食中添加1、2、4 g/kg·BW·d剂量的蔓菁粉,干预后发现,小鼠粪便中的乳酸杆菌和双歧杆菌的数量显著增加(p<0.05),肠球菌和产气荚膜梭菌的数目明显减少(p<0.05),与徐梓荷[20]研究玛咖对肠道菌菌群的影响结果一致,满足《保健食品检验与评价技术规范》中调节肠道菌群的要求[12]。蔓菁对肠球菌和产气荚膜梭菌的抑制作用可能与肠道内益生菌的增殖有关,Alimolaei等[21]研究发现,肠道内某些益生菌或益生菌菌制剂可有效抑制产气荚膜梭菌的增长,本实验结果与其一致。

短链脂肪酸主要由结肠厌氧菌发酵未被消化的碳水化合物形成的,主要包括乙酸、丙酸、丁酸[22-23],具有促进能量代谢,减轻肥胖[24]、消除炎症[25]、改善肠道功能、提高免疫力[26]等功能,短链脂肪酸含量的增加对机体健康具有重要促进作用,所以本研究探讨了蔓菁对小鼠肠道内短链脂肪酸含量的影响。通过蔓菁粉饲喂小鼠发现,干预后小鼠粪样中乙酸、丙酸、丁酸含量均显著增加(p<0.05),推测可能与蔓菁促进肠道益生菌增殖,抑制肠道有害菌的增殖及肠道环境的改变有关,这与徐梓荷[20]研究玛咖对肠道菌群调节,进而对短链脂肪酸含量产生的影响结果一致,具体机制还有待进一步研究。所以日常饮食中添加蔓菁可以有效促进肠道短链脂肪酸的产生,降低肠道pH,维持机体健康。

4 结论

蔓菁可促进肠道益生菌乳酸杆菌、双歧杆菌和中性菌肠杆菌的增殖,中剂量(2 g/kg·BW·d)作用最为明显,且肠杆菌数量增加幅度低于乳酸杆菌和双歧杆菌增加幅度,并抑制中性菌肠球菌和致病菌产气荚膜梭菌的增殖。蔓菁还可促进肠道内乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸的产生,提高短链脂肪酸总含量,且高剂量(4 g/kg·BW·d)作用最为明显。