QuEchERs高效液相色谱柱后衍生法测定茶叶中10种氨基甲酸酯类农药残留

王晓亮,毛卫中,汪新华,楼春兰,吴 飞,陆君羚,周 璇

(开化县检验检测研究院,浙江开化 324300)

茶叶是我国重要的出口经济作物之一。日本和欧盟是我国茶叶的两大出口地,对于茶叶中的农药残留有着严格的限量标准[1-2],农药残留业已成为我国茶叶出口的瓶颈。

QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,rugged,safe的简称)前处理方法是近年来国际上新发展起来的一种样品前处理方法,具有快速、简单、廉价、高效、可靠、安全的优点。目前已经有文献报道QuEChERS方法的应用,除被广泛应用于水果和蔬菜等样品中的农残检测外[3-5],还被应用于油脂类[6]、粮谷类[7]、土壤[8]、中药材[9]、动物源食品[10]等样品中农残检测。

氨基甲酸酯类农药是一类高效、广谱杀虫剂,它是一类以甲酸酯为前体化合物发展而来的农药[11],主要应用在粮食、蔬菜和水果上。目前QuEChERS方法虽然应用广泛,但是应用于茶叶中的氨基甲酸酯检测结合高效液相色谱-柱后衍生荧光法还未见报道,本文着眼于此点开发了此方法,可以对以后的实验者有一定借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶叶样品 开化龙顶,2016年4月茶叶监督抽检样品,一芽一叶,粉碎备用;涕灭威亚砜、涕灭威砜、灭多威、三羟基克百威、涕灭威、速灭威、克百威、甲萘威、异丙威、仲丁威标准品 浓度100 μg/mL,农业部环境保护科研监测所;甲醇、乙腈 色谱纯,TEDIA公司;乙酸、无水乙酸钠 分析纯,天津科密欧化学试剂有限公司;无水硫酸镁 分析纯,天津致远化学试剂有限公司;N-丙基乙二胺(PSA)粉末 艾杰尔科技公司;实验用水 超纯水;柱后衍生试剂套装 邻苯二甲醛(OPA)稀释溶液,货号CB910、水解试剂,货号CB310、邻苯二甲醛(OPA),货号0120、巯基乙醇,货号3700-2000,美国Pickering公司。

Waters e2695高效液相色谱仪 配Waters 2475荧光检测器和柱后衍生装置,美国Waters公司;AL204电子天平 梅特勒-托利多仪器有限公司;HN200氮吹仪 山东海能科学仪器有限公司;Vortex-BE1漩涡混合器 海门其林贝尔仪器制造有限公司;微孔滤膜(0.22 μm) 岛津公司;UPT-I-20T超纯水机 上海优普实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制 准确吸取10种农药标准溶液(浓度100 μg/mL)100 μL置于进样小瓶中,配制成10 μg/mL的农药混合标准储备溶液。用甲醇将10 μg/mL的农药混合标准储备溶液稀释成1.0 μg/mL的农药混合标准工作溶液,然后根据需要用甲醇配制成适当浓度。

1.2.2 柱后衍生试剂的配制 先倾倒5 mL邻苯二甲醛(OPA)稀释溶液于干净小烧杯中用于溶解巯基乙醇,称取100 mg OPA于干净小烧杯中,倾倒10 mL色谱纯甲醇溶解,待完全溶解后倾倒入OPA稀释溶液中,称取2 g巯基乙醇倒入装有OPA稀释溶液的小烧杯中,溶解完毕后倾倒入OPA稀释溶液中。

1.2.3 样品提取和净化 精确称取2.00 g茶叶粉末,加入10.0 mL 0.1%醋酸乙腈提取液,振荡,超声提取10 min加入1.0 g无水硫酸镁,1.0 g无水乙酸钠,涡旋振荡30 s后,4000 r/min离心5 min,吸取5 mL上清液于15 mL已加入1.5 g无水硫酸镁、150 mg PSA粉末的离心管中,轻摇振荡,4000 r/min离心5 min,吸取1 mL上清液于15 mL离心管中,氮气吹干,用1 mL乙腈水(1+1)复溶,过0.22 μm滤膜后供液相色谱分析。

1.2.4 实验条件

1.2.4.1 液相色谱条件 Waters公司氨基甲酸酯农药分析色谱柱(150 mm×3.9 mm,粒径5 μm);柱温42 ℃;进样体积10 μL。液相色谱洗脱条件见表1。

表1 流动相组成及梯度洗脱程序Table 1 The mobile phase and gradient eluted program

1.2.4.2 柱后反应单元及试剂管理单元的设定 柱后反应单元温度:80 ℃;试剂管理单元流速:水解试剂:0.3 mL/min;邻苯二甲醛/巯基乙醇溶液:0.3 mL/min。

1.2.4.3 Waters 2475荧光检测器的设定 激发波长:339 nm,发射波长:445 nm,采集点数:10点/s。

1.3 数据统计分析

利用EXCEL 2010统计分析软件进行数据整理分析,利用Origin 8.5作图。

2 结果与分析

2.1 提取与净化条件的优化

2.1.1 提取条件的优化 茶叶中农残检测样品取样量和蔬菜水果中的农残检测样品取样量差别较大,因为茶叶样品本身含有的干扰物质较多,较大取样量会增大基质中的干扰,相关文献报道过茶叶中农残检测的取样量为2 g或5 g[12-13],因此为了降低干扰,取样量要适度降低,故本方法采用的取样量为2 g。

在提取前是否加水浸泡及提取液的体积选择方面,王翔等[14]详细研究了加水浸泡对于干茶叶中农残提取的影响,发现加水浸泡反而降低了茶叶中农残的提取率。因此本实验提取前不加水。

对于提取液的体积选择方面,查阅相关文献报道,陈磊等[15]详细研究了利用乙腈并采用不同料液比对于提取茶叶中氨基甲酸酯类农残的影响,结果表明料液比为1∶5时回收率最优。陈磊等人所采用的提取过程与本文方法一致,同为提取前不加水浸泡并且提取溶剂也同为乙腈,所以本方法的乙腈提取液体积为10 mL。

无水硫酸镁在提取过程中起到结合提取液中的水分的作用,考虑到茶叶为水分较少的样品,1 g无水硫酸镁结合水后为七水硫酸镁,理论上能够结合1.05 g水,所以2 g茶叶样品中加入1 g无水硫酸镁能够除去多余水分。

2.1.2 N-丙基乙二胺(PSA)净化填料的用量 实验证明,PSA净化填料的加入能够显著除去茶叶中的脂肪酸、糖类和一些色素等干扰物质,使提取液得到有效净化。PSA的加入能够去除茶叶中的干扰物质,同时也会在一定程度上吸附目标农药,降低回收率[16]。因此,在实验中需要综合考虑净化填料的使用量。分别实验了添加150、300、500 mg PSA净化填料的农药回收率,结果显示添加150 mg PSA和300 mg PSA的农药平均回收率分别为88.77%和86.34%,都符合GB/T 27404-2008中关于回收率在80%～110%之间的技术要求,而添加500 mg PSA的农药平均回收率为78.84%,并不符合相关要求。考虑回收率和成本的因素,因此本实验选用150 mg PSA作为净化填料的添加量。

2.2 相关性实验

吸取十种氨基甲酸酯农药混合标准工作液(1.0 μg/mL)适量,用甲醇稀释成浓度为0.01、0.05、0.10、0.20、0.50 μg/mL的标准系列,分别吸取10 μL标准混合溶液和净化后的样品溶液注入液相色谱仪中,以保留时间定性,以峰面积定量。其色谱图分别见图1和图2。上述十种氨基甲酸酯农药在0.01～0.50 μg/mL浓度范围内呈良好的线性,相关系数均达到0.9996以上。结果见表2。

表2 10种氨基甲酸酯农药回归方程、相关系数、线性范围及检出限和定量限Table 2 Linear equations,correlation coefficients(R2),linear rangs,detection limits and quantization limits of 10 carbamates pesticide

图1 10种氨基甲酸酯农药标准色谱图(500 ng/mL)Fig.1 Standard chromatography of 10 carbamate pesticides(500 ng/mL)

2.3 检出限(LOD)和定量限(LOQ)

在阴性茶叶样品中分别添加涕灭威亚砜、涕灭威砜和灭多威0.02 mg/kg做检出限测定,添加0.05 mg/kg做定量限测定;分别添加三羟基克百威、涕灭威、速灭威、克百威、甲萘威、异丙威和仲丁威0.01 mg/kg做检出限测定,又添加0.05 mg/kg做定量限测定,以S/N(信噪比)=3的浓度为检出限,以S/N(信噪比)=10的浓度为定量限,结果见表2。

2.4 回收率与精密度实验

用十种氨基甲酸酯农残为阴性的茶叶样品进行加标回收实验,对样品进行0.1、0.25、0.5 mg/kg三个水平的添加,每个水平平行测定6次,结果见表3,测得平均回收率为81.98%～95.59%,相对标准偏差(RSD)为1.22%～4.98%,说明该方法重现性好,精密度高,达到分析要求。

表3 10种氨基甲酸酯农药回收率(n=6)Table 3 Recoveries of 10 carbamate pesticides

3 结论

本文建立了Quechers前处理-高效液相色谱柱后衍生荧光法检测茶叶中10中氨基甲酸酯农药残留的方法。相对于传统的氨基柱净化方法,本方法简便、高效,通过提取净化条件的优化,梯度洗脱分离,10种氨基甲酸酯农药在24 min内能够达到较好分离。方法学结果表明该方法的回收率高,重复性好,精密度高,适合于茶叶中的氨基甲酸酯农药残留分析测定。