4种典型谷物中酚类化合物的抗氧化和抗癌细胞增殖活性

姚 惠,赵 彬,崔洁媚,段玉清,张海晖,张 迪,蔡梅红

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

植物酚类化合物是高等植物的一种次级代谢产物,是植物化学物质的主要组分之一[1],广泛分布于蔬菜、水果、香辛料、谷物、豆类和果仁等各种高等植物器官中,主要分为植物黄酮类、植物酚酸类和植物单宁类这3大类[2]。近年研究表明,植物酚类化合物具有抗氧化、调节免疫、延缓衰老、抗辐射等多种生物活性[3-5],且具有一定的抗癌作用[6-8],并因同时具有天然、高效、毒性低等特点而备受消费者青睐。全谷物食品被认为是谷物在加工过程中仅仅去掉谷物最外面的谷壳,保留下完整的胚芽与糊粉层的谷物食品。近年来全谷物食品越来越受到人们的欢迎,食用全谷物食品有良好的保健作用。全谷物中含有酚类化合物、植酸、维生素等在内的丰富生物活性成分,比其他谷物具有更高的营养价值。谷物种类是影响谷物中酚类化合物含量的主要因素之一,不同种类谷物中的酚类化合物含量相差较大[9-12]。

基于此,本文以4种常见的全谷物荞麦、大麦、小麦、水稻为原料,通过初步分离和纯化,明确其总酚(The total phenolic contents,TPC)和总黄酮含量(The total flavonoid contents,TFC),利用HPLC-MS初步鉴定了4种谷物中酚类化合物的组成。在此基础上,初步研究4种谷物中酚类化合物的组成、抗氧化性和抗癌细胞增殖活性,并探讨其酚类物质含量与抗氧化活性和抗癌细胞增殖活性之间的相关性,为谷物酚类物质的进一步研究提供一定理论基础和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

荞麦、大麦、小麦、水稻 镇江市场(同年收获);结肠癌细胞Caco-2细胞 上海细胞库;胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶 美国Gibco公司;四甲基偶氮唑盐试剂(MTT)、DPPH试剂,二甲基亚砜(DMSO) 美国Sigma公司;DMEM高糖培养基、非必需氨基酸(Nonessential Amino Acid,NEAA) Hyclone公司;甲醇(HPLC级) 美国TEDIA公司;没食子酸(≥99.8%) 中国食品药品鉴定研究院;其他常用试剂略。

BS224S型电子精密分析天平 Sartorious Germany公司;ALPHAI-4/2-4型冷冻干燥机 德国CHRIST公司;DL-5C型离心机 上海安亭有限公司;HERAcell240i CO2培养箱 美国Thermo公司;Tecan Infinite PROTWIN200型多功能酶标仪 瑞士帝肯公司;ThermoLXQ型高效液相色谱-质谱联用仪 美国Thermo公司;ZORBAX SB-C18液相色谱柱(250 mm×4.6 μm) 美国安捷伦公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酚类化合物的提取和纯化 将4种谷物脱去谷壳,粉碎机粉碎,过60目筛,用石油醚对粉末脱脂,过滤,收集残渣后置于-20 ℃冷藏。分别称取各样品粉末50 g,与70%(v/v)乙醇混合,料液比为1∶15 (g∶mL),于45 ℃条件下浸提,浸提液过滤,收集上清液,残渣按照上述方法重复浸提2次[13]。合并2次浸提液,于45 ℃下减压浓缩至无醇后,以5倍柱体积的浸提液进行上样(流速为2 mL/min),经AB-8大孔吸附树脂分离/富集,以体积70%乙醇水洗脱(洗脱流速为2 mL/min),收集乙醇洗脱液,45 ℃下减压浓缩,经-70 ℃冷冻干燥得到酚类化合物粉末,于-20 ℃密封保存,备用。

1.2.2 TPC的测定 采用Folin-clocalteau[14-15]法,略有改动。标准曲线的测定:以没食子酸为标准品。将没食子酸标准溶液梯度稀释为18.75、37.5、75、150、300 μg/mL。取1 mL标准溶液与4.0 mL Folin试剂(10倍稀释)混合,再加入5.0 mL7.5%的Na2CO3溶液,25 ℃水浴2 h,于765 nm处测定其OD值(水和试剂的混合物作为空白),并绘制标准曲线,标准曲线方程为:y=0.00825x+0.02047(R2=0.9983)。样品测定:不同种类谷物酚类提取物样品按照上述方法测定其OD值,样品TPC用没食子酸当量[GAE mg/100 g干重(dw)]表示。

1.2.4 4种谷物酚类物质组成的HPLC-MS分析 采用高效液相质谱联用测定谷物中酚类物质的组成,结合文献[17-19]进行测定,色谱条件为:液相色谱柱为ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 μm);流动相由含有1.0%(v/v)冰乙酸的超纯水(A)和甲醇(B)组成。洗脱梯度:0～10 min,5%～30% B;10～25 min,30%-50% B;25～35 min,50%～70% B;35～40 min,70～95% B。流速为1.0 mL/min,进样量为10 μL,检测波长为280 nm。

质谱条件为:ESI离子源负离子检测模式,离子源正离子检测模式1.8 kV,使用氮气作为干燥和雾化气体,流速为1.0 mL/min,进样量为10 μL,扫描波长为50～2000 m/z。

1.2.5 还原能力的测定 采用文献[20-21],略有改动。将一定质量的谷物提取物粉末溶解后配制成适当浓度的样品溶液。将1.0 mL样品溶液与2.5 mL磷酸盐缓冲溶液(pH6.6)及2.5 mL 10%的三氯乙酸,充分混合后在3000 r/min的条件下离心10 min,吸取2.5 mL的上清液,加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%的FeCl3溶液,充分混合后于700 nm处测定其OD值。以抗坏血酸(VC)作为阳性对照。

1.2.6 DPPH自由基清除率的测定 采用文献[22-24],略有改动。取一定质量不同种类谷物提取物粉末溶解后配制适当浓度的样品溶液。取2.0 mL 0.25 mmol的DPPH·溶液与2.0 mL的样品溶液充分混匀,避光放置30 min,测定517 nm处OD值(以2.0 mL DPPH·溶液和2.0 mL蒸馏水的混合物作为空白对照)。以VC作为阳性对照。对DPPH·清除率计算公式如下:

式中:A0为2.0 mL DPPH·+2.0 mL无水乙醇的OD值;Ai为2.0 mL DPPH·+2.0 mL样品溶液的OD值;Aj为2.0 mL无水乙醇+2.0 mL样品溶液的OD值。

1.2.7 对结肠癌Caco-2细胞增殖的影响 采用MTT分析法检测4种谷物对Caco-2细胞增殖能力[25-26]。取对数期的Caco-2细胞经胰蛋白酶消化后,以2.0×104个细胞/孔的密度接种在96孔板中,孵育24 h后,经100 μL不同浓度的样品(0～100 μg/mL,用生长培养基稀释制备)37 ℃下处理72 h。处理结束后吸除旧的培养基,加入100 μL 1.0 mg/mL 的MTT溶液,37 ℃下孵育4 h,孵育完后加入150 μL的DMSO,使用多功能酶标仪测定490 nm处其OD值。按照下列公式计算增殖抑制率:

式中:At为样品组OD值;Ac为对照组OD值。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 4种谷物酚类提取物中TPC及TFC的含量

4种谷物纯化后TPC和TFC含量如表1所示。由表中可知,不同谷物中TPC和TFC含量之间均存在显著差异(p<0.05)。其中TPC含量在63.37～465.66 GAE mg/100 g dw之间,而TFC 含量介于58.79～930.42 RTE mg/100 g dw之间。TPC和TFC含量从高到低均依次为:荞麦>大麦>水稻>小麦。其中荞麦的TPC和TFC含量均显著高于其他三种谷物提取物(p<0.05),大麦和水稻的TPC和TFC含量之间均无显著差异,而小麦的TPC和TFC均最低。

表1 4种谷物酚类提取物中总酚和总黄酮含量Table 1 Total polyphenol and flavnoid contents of four grian extracts

2.2 4种典型谷物中酚类化合物组成的初步鉴定

2.2.1 HPLC分析 图1为4种谷物酚类化合物的HPLC图,从图可见在本分析条件下4种谷物酚类化合物均能很好的分离。

图1 四种谷物的HPLC图Fig.1 Chromatogram of four grain extracts注:A.荞麦;B. 大麦;C. 水稻;D.小麦。

2.2.2 酚类化合物的MS分析 基于其保留时间和MS数据并结合参考文献[19],从荞麦中成功鉴定出15种酚类化合物,见表2。荞麦中的酚类化合物主要为黄酮类化合物及其衍生物。其中,A2,A3,A4,A5,A7,A8,A9和A11被鉴定为黄烷-3-醇类。黄烷-3-醇(flavan-3-ol)属于黄烷醇类化合物,主要包括儿茶素、表儿茶素及其衍生物,是黄酮类化合物中非常重要的一类物质。A12和A13的[M-H]-和MS2均相同,但是保留时间不同,这说明两者属于同分异构体。大麦、小麦和水稻中的酚类化合物明显少于荞麦。基于其保留时间和MS数据并结合参考文献[19],在大麦、小麦、水稻提取物中分别成功鉴定出5、3、4种酚类化合物,见表2。

表2 4种谷物提取物中酚类化合物的HPLC-MS分析Table 2 Identification of phenolic compounds of buckwheat

从表2中可见,3种谷物中均含有黄烷-3-醇类化合物(B2、B4、C1、C2、D1)。而大麦和小麦都属于麦类,均含有芹菜素的衍生物(B3、D2、D3),其中D2和D3的[M-H]-和MS2相同,而保留时间不同,属于同分异构体。

2.3 四种谷物酚类提取物的抗氧化性

由于化学分析法检测抗氧化能力的局限性,一般使用两种或两种以上具有不同氧化机制的检测方法分析抗氧化能力。

2.3.1 还原能力分析 通过测定在4种谷物酚类提取物存在下,Fe3+转化为Fe2+的情况判定其还原能力。由图2能够看出,4种谷物酚类提取物均具有一定还原能力,且存在剂量依赖效应。同时,我们还发现不同种类的谷物之间,还原能力有着显著差异(p<0.05)。荞麦的还原能力高于VC,当样品浓度为200 μg/mL时,OD700值为0.897。而小麦的还原能力最弱,样品浓度为200 μg/mL,OD700值仅为0.582。综上,四种谷物酚类提取物的还原能力强弱依次为:荞麦>大麦>水稻>小麦。

图2 4种谷物酚类提取物还原能力Fig.2 Reducing power of four grain extracts

2.3.2 DPPH自由基清除能力 DPPH·比较稳定,可以长时间保存,广泛应用于测定抗氧化剂的自由基清除能力,从而判断其抗氧化活性。由图3能够发现,四种谷物酚类提取物均具有一定的DPPH·清除能力,DPPH·清除率随着样品浓度的增加前期显著增加,而后清除率逐步趋于稳定。同时,我们还发现不同种类的谷物之间,DPPH·清除能力有着显著差异(p<0.05)。其中,荞麦的DPPH·清除能力最高,200 μg/mL时,荞麦的DPPH·清除率达到86.10%(同浓度VC的清除率为91.00%)。而小麦对DPPH·清除能力最弱,200 μg/mL时,清除率仅为39.21%。综上,四种谷物酚类提取物的DPPH·清除能力强弱顺序依次为:荞麦>大麦>水稻>小麦。

图3 4种谷物酚类提取物的DPPH·清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging activity of four grain extracts

2.3.3 4种谷物酚类提取物对Caco-2细胞增殖的抑制作用 在活细胞中,MTT与细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶作用被还原成深紫色结晶物甲臜,并堆积在细胞中,含量与活细胞的数目成正比,但是在死细胞中不能产生发生这种反应。从图4可以看出,4种谷物酚类提取物均具有一定的抗Caco-2细胞增殖的能力,且存在剂量依赖效应。其中,荞麦对Caco-2细胞增殖的抑制能力最强,当样品浓度为100 μg/mL时,抑制率可达55.62%。这4种谷物在低浓度(20～40 μg/mL)时抗Caco-2细胞增殖活性较弱,在高浓度(100 μg/mL)时,4种谷物酚类提取物的抗Caco-2细胞增殖活力大小依次为:荞麦>大麦>水稻>小麦。

图4 4种谷物酚类提取物抗Caco-2细胞增殖能力Fig.4 Inhibition effects of four grain extracts on Caco-2 cells proliferation

2.4 4种谷物酚类物质与抗氧化和抗癌细胞增殖活性的相关性

由表3能够看出,TPC和TFC与抗氧化、抗癌细胞增殖之间存在一定的相关性。总酚含量和总黄酮含量与还原能力之间的相关性良好,分别达到0.933,0.960,酚类化合物与DPPH·清除能力之间也具有一定的相关性。同时,抗氧化活性与抗癌细胞增殖能力之间也具有较强的相关性(与DPPH·清除能力 r=0.987,与还原能力r=0.925),其中抗癌细胞增殖活性与DPPH·清除能力之间的相关性系数存在显著性关系(p<0.05)。

表3 谷物酚类提取物中总酚和总黄酮含量与其抗氧化和抗癌细胞增殖能力的相关性分析Table 3 Correlation analysis of total phenolic contents,flavnoid contents,antioxidant activity and anti-cancer activity

3 结论

4种谷物后酚类化合物(TPC和TFC)的含量从高到低的顺序依次为:荞麦>大麦>水稻>小麦。从4种谷物中确定了21种酚类化合物,其中荞麦中酚类化合物种类较多。4种谷物酚类化合物均具有一定的抗氧化和抗Caco-2细胞增殖活性的能力,而且存在剂量依赖关系;其酚类化合物的含量与其抗氧化活性和抗Caco-2细胞增殖活性之间以及抗氧化活性与抗Caco-2细胞增殖活性之间均具有较好的相关性。

植物酚类化合物具有多种生理活性,如抗过敏、抗炎、抑制微生物、抗氧化、抗肿瘤等作用,并且具有天然、高效、低毒等优点。因此,植物酚类化合物在食品、药品、化妆品行业具有广阔的发展前景。谷物是东方人膳食结构中的重要组成部分,且酚类物质含量丰富。然而,目前国内外有关植物酚类化合物的研究多集中于果蔬和茶叶方面,有关谷物酚类化合物及其生理活性方面(特别是抗癌能力方面)的研究相对较少,本文正是基于这种背景下对4种典型谷物中的酚类化合物进行了研究,为谷物酚类化合物的深入研究提供参考。