橄榄渣提取物对马肉饼的抗氧化作用

杨志攀,孔令明,*,冯宪超,汪雪娇,陈悦菲

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院,新疆乌鲁木齐 830052;2.西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100)

马肉营养丰富,具有高蛋白、低胆固醇、高不饱和脂肪酸、营养素搭配合理的特点,而且味美可口,从而逐渐受到消费者青睐。尤其是日本、美国、西欧等一些国家大量进口马肉以满足日益增长的市场需求[1]。

然而,马肉中不饱和脂肪酸含量高,在贮藏过程中容易发生氧化变质导致保质期缩短。氧化变质(脂质和蛋白质氧化)被认为是降低肉制品质量的主要因素之一[2]。这些变化在生肉制品中比在活体肉中更易发生,这是由于肉的自由基清除系统被削弱,并且与空气的接触面积增大[3]。脂质过度氧化还可能产生有毒有害物质,增加食用风险。脂质氧化反应产生的初级产物及次级产物化学性质不稳定,容易与肉中的其他成分(蛋白质、血红素、抗氧化添加剂等)发生反应从而影响肉制品的品质[4]。肌肉蛋白的氧化会使肉品色泽变暗、持水性和嫩度下降,食用品质劣变,营养价值降低,消费者接受程度下降[5]。天然抗氧化提取物具有较高的安全性、无副作用和防腐保鲜等优点,得到了广泛的关注。因此,许多学者致力于肉制品天然抗氧化剂的研发。例如,石榴皮提取物等对蛋白质和脂质氧化有抑制作用[6],迷迭香提取物对猪肉脂质氧化有抑制作用[7]。

橄榄渣是橄榄油工业副产物,其富含大量的有机物质,例如糖、单宁、多元醇、果胶、脂质和酚类[8]。橄榄渣中的酚类主要为脱咖啡酰基毛蕊糖苷(decaffeoylverbasco-side,3,DA)、木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷(Luteolin-7-O-β-D-glucoside,LE)、6″-O-β-D-吡喃葡萄糖-橄榄苦苷(6″-O-β-D-glucopyranosyl oleuropein,GO)和橄榄苦苷(Oleuropein,OR)[9]。多酚可以通过清除自由基和螯合过渡金属离子从而达到抑制氧化的目的。多酚的抗氧化活性是以其作为氢原子供体的能力为基础,以中和自由基的活性[10]。一般而言,羟基酪醇和类烯丙醇衍生物的二羟基结构特征似乎是这些多酚的高抗氧化活性的主要原因,其次是4-O单羟基化合物(噻吗啉和酪醇)和3-O羟基取代的儿茶酚[8]。因此,橄榄果渣成为天然抗氧化剂的廉价来源。

在中国,橄榄被大量种植在甘肃、广东、广西、云南、四川等地区[11],每年生产可观的橄榄油,产生了大量的橄榄渣。目前,我国橄榄油企业产生的橄榄渣还没有较好的利用方法,大量被丢弃。本研究采用橄榄渣提取物作为天然抗氧化剂,将其加入马肉饼中,探究不同浓度得橄榄渣提取物对马肉冷藏过程中色泽、脂质氧化、蛋白氧化的影响。从而为橄榄渣的废物利用,改善马肉饼贮藏过程的品质提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜橄榄渣 2016年12月由甘肃武都县翔宇油橄榄有限公司提供;马里脊肉 购于新疆乌鲁木齐市朱兰青肉制品批发市场;MDA试剂盒 南京建成生物科技有限公司;福林酚(FCR)、1,1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH)、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)、α,α二甲基苄基过氧化氢、硫氰酸铵、2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、没食子酸标准品、盐(纯度≥98%) Aladdin试剂公司;其他试剂 均为市售,国产分析纯。

AL104型电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;H2050R型台式离心机 长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司;UVmini-1240型紫外-可见分光光度计 日本京都岛津制作所;KH5200B型超声波清洗器 昆山禾创超声仪器有限公司;IKA T18型高速匀浆机 上海楚柏实验室设备有限公司;UltraScan PRO色差仪 美国Hunterlab公司。

1.2 实验方法

1.2.1 橄榄渣提取物的制备 准确称取500.00 g橄榄渣,以料液比1∶1.5的比例加入80%的乙醇,750 W的功率条件下超声波提取20 min,在12000 r/min的条件下进行离心15 min。此操作重复进行3次,合并上清液得到粗提液。将粗提液在38 ℃下旋蒸浓缩。浓缩物在-80 ℃条件下冷冻,在冷冻干燥器中冷冻干燥48 h,为橄榄渣提取物,备用。

1.2.2 总酚含量的测定 橄榄渣提取物中总酚含量的测定参照刘丽香等[12]的福林酚法,并稍作修改。多次预实验后,将0.2 mL质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的橄榄渣提取物与1.5 mL 0.2 mol/L Folin-酚试剂混合后避光反应5 min。然后加入1.5 mL 75 g/100 mL碳酸钠溶液,避光反应1 h后,用分光光度计于725 nm波长处测吸光度。参考标准曲线y=0.0106x-0.0038R2=0.9959,总酚含量用没食子酸(gallic acid,GA)当量(每克样品干质量中酚类化合物相当于没食子酸的毫克数,mg GAE/g DW)表示。

1.2.3 DPPH自由基清除能力测定 DPPH自由基清除能力测定参考Garzón等[13]方法,并稍作改动。取1 mL的20、40、60、80、100 μg/mL浓度橄榄渣提取物溶液分别与1 mL 0.1 mmol/L DPPH自由基醇溶液混合。避光反应30 min后,以蒸馏水作为参比于517 nm处分别测定吸光度。根据下列公式计算清除率:

式(1)

式中:A0为空白在517 nm处吸光度;A1为样品在517 nm处吸光度。

1.2.4 ABTS+·清除能力测定 ABTS+·清除能力测定参考Mjtj等[14]的方法,稍作改动。ABTS溶液(7 mmol/L)与过硫酸钾溶液(7.35 mmol/L)按2∶1(V/V)混合,室温避光反应16 h得到ABTS+储备液。将ABTS+储备液用甲醇稀释至在734 nm波长处吸光度达到0.70±0.02,即得ABTS+工作液。多次实验后,将2、4、6、8、10 mg橄榄渣提取物与100 mL 80%的乙醇混合,各取25 μL 橄榄渣提取物溶液与2 mL ABTS+工作液混合,避光反应6 min后,于734 nm波长处测量各样品的吸光度。用蒸馏水代替ABTS+工作液作为空白。

式(2)

式中:A样品为样品在734 nm处吸光度;A空白为空白在734 nm处吸光度。

1.2.5 马肉饼的制作 基本配方:以马肉后腿肉(1000.00±1.00) g计,加入(100.00±0.10) g水,(10.00±0.01) g盐。空白组为基本配方,其样品组分别添加0.2%、0.4%、0.6%的橄榄渣提取物,阳性对照组添加0.1%的BHT。剔除马肉上可见筋膜,用刀间距为2 mm的切丁机进行切碎处理,此过程重复5次,以保证肉糜的均匀程度。准确称量的基本配料和原料肉充分搅拌,用模具将搅拌均匀的肉糜定型成直径为10 cm、厚度为1 cm的肉饼,参照Jia等[15]的肉饼包装及贮藏方法,将肉饼放入聚丙烯盘中,用聚乙烯保鲜膜严密覆盖,然后将包装好的肉饼放入展示冷藏柜中4 ℃贮藏。由于每次测定时多个指标不能同时完成,所以分别在0、3、6、9 d取样,并放置到-80 ℃冷冻柜中待测。

1.2.6 指标的测定

1.2.6.1 色差的测定 参照Moroney等[16]的方法,并略作修改。色差仪使用前先用标准板进行校正(Y=97.43,x=+0.39,y=+1.08),再采用D65光源,以未添加任何试剂的马肉饼作为空白组,添加0.2%、0.4%和0.6%橄榄枝提取物的作为样品组,添加0.1% BHT的作为阳性对照组。对肉饼表面的色泽(亮度L*、红度a*、黄度b*)进行测定。

1.2.6.2 高铁肌红蛋白的含量的测定 参照Warris[17]的方法从生肉饼中提取肌红蛋白,略作修改。将未添加任何试剂的马肉饼作为空白组,添加0.2%、0.4%和0.6%橄榄枝提取物的作为样品组,添加0.1% BHT的作为阳性对照组。分别与5倍质量的磷酸盐缓冲液(40 mmol/L,pH=6.8)混合,然后在匀浆器中均质10 s。在4 ℃条件下放置1 h后,3500×g、4 ℃离心30 min。 通过滤纸过滤进一步澄清上清液。用分光光度计在525、572、700 nm下测量滤液的吸光度。 根据以下公式计算高铁肌红蛋白(Met Mb)含量。

式(3)

1.2.6.3 过氧化值的测定 参照Park等[18]的方法,略作修改。向1 g马肉饼(以未添加任何试剂的作为空白组,添加0.2%、0.4%和0.6%橄榄枝提取物的作为样品组,添加0.1% BHT的作为阳性对照组)中加入10 mL氯仿/甲醇(2∶1)提取脂质氢过氧化物。2000×g离心5 min后,取下层氯仿层2 mL与另外1.3 mL氯仿/甲醇(2∶1)混合,然后分别加入16.7 μL硫氰酸铵(3.94 mol/L)和氯化亚铁(0.072 mol/L)。在室温下温育20 min后,在500 nm处测量吸光度,并且基于由氢过氧化枯烯制备的标准曲线计算过氧化值[19]。

1.2.6.4 丙二醛含量的测定 丙二醛含量的测定通过丙二醛检测盒检测,所有步骤完全按照操作说明进行。以未添加任何试剂的马肉饼作为空白组,添加0.2%、0.4%和0.6%橄榄枝提取物的作为样品组,添加0.1% BHT的作为阳性对照组。

1.2.6.5 羰基含量的测定 参照 Zhou等[20]的方法,略作修改。用0.6 mol/L的NaCl溶液将氧化后的肌原纤维蛋白配制成100 mg/mL蛋白溶液,取150 uL蛋白溶液,加入1 mL 20%的三氯乙酸(TCA),在4 ℃的条件下,以3040×g离心10 min,弃去上清液,加入1 mL的0.2%的DNPH(用2 mol/L的HCl 配制),避光振荡1 h后,加入0.5 mL 20%的三氯乙酸(TCA),离心(4000×g,4 ℃,10 min),沉淀用 1.5 mL乙酸乙酯和乙醇(1/1,V/V)洗涤 3 次,并加入1.5 mL 6 mol/L的盐酸胍溶液溶解沉淀(37 ℃,15 min),最后离心(500×g,4 ℃,5 min),测定上清液的 A370nm值。蛋白溶液含量用考马斯亮蓝法测定。

蛋白质羰基含量(nmol/mg)=(测定OD-对照管OD)/[22×比色光径(cm)×样品蛋白浓度(mg/L)]×125×105

式(4)

1.3 数据处理

实验重复3次。所得数据用Excel 2003处理,SPSS 17.0进行方差分析,用Duncan’s Multiple Range Test进行多重比较分析,显著水平为p<0.05。

2 结果与分析

2.1 橄榄渣提取物总酚含量的测定

橄榄渣提取物的总酚含量为(70.82±7.34) mg GAE/g DW。Bahar等[21]测定橄榄油中的总酚含量为64.19 mg GAE/g DW。说明橄榄渣中的总酚含量较高。植物多酚的多羟基结构赋予其一系列独特的化学性质,而植物酚类与蛋白质的结合是其最重要的特征,蛋白质与多酚相互作用会引起蛋白质结构的改变,导致蛋白质的疏水-亲水性的相应变化以及溶解度的改变。这些变化将会影响蛋白质的功能性质(例如乳化性、起泡性等)[22]。

2.2 橄榄渣提取物抗氧化活性

图1所示,橄榄渣提取物的DPPH自由基清除能力都随其浓度的升高而升高,但是当提取物浓度为80与100 μg/mL时,DPPH自由基清除率无显著性差异(p>0.05)橄榄渣提取物的DPPH自由基清除率最大值达到80.07%,说明它们具有有效降低羟自由基、烷自由基或过氧自由基浓度、中断脂质过氧化链反应的作用[23];橄榄渣提取物的ABTS+·清除能力随其浓度的升高而升高,它是一种清除还原性离子的氧化自由基,其测定的清除率越高,表明橄榄渣提取物中还原性自由基含量越高但与DPPH自由基清除率相比较低,其原因是两种电子的转移速率不同。

图1 橄榄渣提取物质量浓度对DPPH和ABTS+自由基清除能力分析Fig.1 Effect of olive extract concentration on DPPH and ABTS+ free radical scavenging capacity

2.3 橄榄渣提取物对马肉饼色泽的影响

2.3.1 色差分析 由表1可知,前3 d无论是空白组还是不同橄榄渣提取物浓度的处理组,L*值均显著升高(p<0.05),说明马肉的颜色变化主要发生在前3 d。随后3～9 d中0.2%的橄榄渣提取物使马肉饼的L*值显著降低(p<0.05),与BHT组一致,而0.4%和0.6%则使L*值小幅上升,这可能与马肉饼中脂肪分布不均匀有关。a*为正值,代表肉饼的红度。在贮藏过程中(3～9 d),与空白组相比,添加橄榄渣提取物使肉饼的a*升高。这可能是由于橄榄渣提取物可以阻止肌红蛋白的氧化褐变。尤其是在6～9 d内,与空白组相比,在相同测试天数时,a*值随橄榄渣提取物添加量的增加而升高,0.6%橄榄渣提取物能使马肉饼的a*值显著提高(p<0.05)。

表1 橄榄渣提取物不同添加量对马肉饼贮藏过程中颜色(L*,a*,b*)的影响Table 1 Effects of different amount of Olive Pomace extract on color(L*,a*,b*)of horse patties during storage

随着贮藏时间的增加,a*值逐渐降低,在0～3 d的过程中L*值与a*值呈相反变化,出现上升趋势,在添加0.4%橄榄渣提取物时,L*值出现了一定的波动,这种波动可能是因为在制作马肉饼时脂肪未能均匀分布所致。0.6%的橄榄渣提取物对a*值得影响略低于0.1% BHT,但是差值小于1。因此,消费者很难察觉含有0.6%的橄榄渣提取物的马肉饼与含有0.1% BHT的马肉饼之间的红度差异。这说明0.6%橄榄渣提取物可以用来替代BHT的使用,具有稳定肉色的功效。

在0～9 d的贮藏过程中,空白组b*值有一定的升高。b*代表肉饼的黄度,与脂肪氧化有关。这说明橄榄渣提取物可能通过阻止肉饼中脂肪的氧化,从而稳定肉饼的黄度。

2.3.2 高铁肌红蛋白含量分析 由图2可知,第0 d时,所有肉饼的高铁肌红蛋白(MetMb)含量均低于20%;除了对照组的之外,其他实验组相互间差异不显著(p>0.05)。随着贮存天数的增加,所有样品的MetMb含量均逐渐升高,这可能是由于马肉中肌红蛋白受到了氧化攻击,从而导致马肉的红色逐渐变淡。这与色差测定结果是一致的(表1)。与空白组相比,随着贮藏时间的增长,添加了橄榄渣提取物的样品(0.2%、0.4%、0.6%)的MetMb含量显著降低(p<0.05),且MetMb含量随着橄榄渣提取物浓度的增加而显著降低(p<0.05)。尤其在第6 d时0.6%橄榄渣提取物组的MetMb含量为33.7单位,与0.1% BHT组一致。以上结果说明橄榄渣提取物可以阻止马肉饼中肌红蛋白的氧化,且0.6%橄榄渣提取物抑制效果与0.1% BHT的抑制效果相近。

图2 橄榄渣提取物不同添加量对马肉饼贮藏过程中高铁肌红蛋白的影响Fig.2 Effect of the amount of olive pomace extract of metmyoglobin horse patties during storage注:字母不同,表示差异显著(p<0.05)。

2.4 橄榄渣提取物对马肉饼脂质氧化的影响

2.4.1 过氧化值 过氧化值是评估脂肪初始氧化程度的重要指标。抗氧化剂添加和贮存时间都对过氧化值有显著的影响。由图3可知,马肉饼的过氧化值随着橄榄渣提取物添加量的增高而降低,但是显著高于0.1% BHT组(p<0.05)。在对照样品中观察到最高的初始过氧化值,在第3 d达到过氧化值的阈值,随后快速下降。这种现象可被解释为,空白样品在冷藏贮存的前3 d内经历明显的脂质氧化,并在初次自动氧化结束时达到最大过氧化值,贮存3 d后,形成的氢过氧化物可能已分解形成次级氧化产物[24]。

图3 橄榄渣提取物不同添加量对马肉饼贮藏过程中过氧化值的影响Fig.3 Effect of the amount of olive pomace extract on different peroxide value of horse patties during storage

2.4.2 硫代巴比妥酸(TBARS)值 脂质氧化产物丙二醛可以与硫代巴比妥酸反应生成有色化合物,由此来衡量肉饼中的脂质氧化程度。由图4可知,与对照组相比,添加橄榄渣提取物和BHT在整个贮藏过程中均能使马肉饼的TBARS值显著下降(p<0.05),说明橄榄渣提取物和BHT均能抑制脂质氧化,这归因于其酚类物质可以通过阻断自由基链式反应来抑制脂质氧化[25]。此外,马肉饼的TBARS值随橄榄渣提取物浓度的升高而逐渐降低,且0.6%橄榄渣提取物组的TBARS值与0.1% BHT组相当,说明0.6%的橄榄渣提取物与0.1% BHT发挥同样的抗脂肪氧化效果。随着贮存时间的增长,空白组、0.2%、0.4%组马肉饼的氧化程度显著加深,但0.6%橄榄渣提取物和0.1%BHT能显著抑制脂质氧化,且使脂质氧化速率达到最低。这些结果表明,使用天然抗氧化剂可以有效地防止肉饼在冷藏过程中的脂质氧化。

图4 橄榄渣提取物不同添加量对马肉饼贮藏过程中硫代巴比妥酸值的影响Fig.4 Effect of different additives of olive slag extracts on the thiobarbituric acid value in the storage of horse patties

2.5 橄榄渣提取物对马肉饼蛋白氧化的影响

蛋白质羰基含量用于衡量肉饼冷藏保存期间肌肉蛋白质的氧化程度。羰基含量增加表明肌肉蛋白受到氧化应激,导致一些氨基酸侧链的氧化,如赖氨酸、脯氨酸、精氨酸和组氨酸残基[26]。由图5可知,随着贮存时间的增长,蛋白质的氧化程度逐渐加深,但高浓度橄榄渣提取物对肉饼脂质氧化的抑制作用,显著高于低浓度橄榄渣提取物的抑制作用(p<0.05)。值得注意的是,空白组和0.2%橄榄渣提取物组在6 d时由于蛋白质的羰基与游离胺基相互反应形成的席夫碱结构[27]。而其他各实验组还未能形成席夫碱结构,所以在9 d时空白组与0.2%橄榄渣提取物组开始下降,0.4%、0.6%橄榄渣提取物组、0.1% BHT组继续处于上升状态。研究发现普通山楂,狗蔷薇和榆树叶黑莓提取物在冷藏贮存期间的12 d内能够有效降低馅饼中的羰基形成;油菜籽和松树皮提取物在熟猪肉馅饼中也观察到类似的抑制作用[28]。

图5 不同浓度橄榄渣提取物对马肉饼贮藏过程中羰基含量的影响Fig.5 Effect of different concentrations of olive pomace extract on the carbonyl content of horse patties during storage

3 结论

本研究评估了橄榄渣提取物的总酚含量及其抗氧化能力,发现橄榄渣提取物总酚含量达到(70.82±7.34) mg GAE/g DW,并显示出较强的清除DPPH和ABTS自由基的能力。将不同浓度橄榄渣提取物加至马肉饼中,发现其对脂质和蛋白氧化具有明显的抑制作用,并能够稳定肉饼的色泽褪变。因此,使用橄榄油行业副产物—橄榄渣提取物作为天然抗氧化剂,可以作为天然抗氧化剂用来替代合成抗氧化剂,如BHT,应用到肉类产品中,既可满足消费者对食品健康和安全品质的需求,也可为橄榄加工副产品的应用提供参考。