石河子垦区集约化奶牛场子宫炎主要病原菌的分离鉴定

刘长彬,卢春霞,罗小玲，侯扶琴,姜志涛,陈红莉

(1. 新疆农垦科学院畜牧兽医研究所，新疆 石河子 832000； 2. 新疆西部牧业股份有限公司，新疆 石河子 832002；3.新疆农垦科学院分析测试中心，新疆 石河子 832000)

【研究意义】奶牛子宫炎(Endometritis)是一种奶牛常见、多发性疾病，给奶牛生产上带来很大的经济损失，常发生于产犊后和配种期。由于产犊后和配种期子宫颈口开张，容易受到致病菌的侵袭，而引起子宫内膜炎症。另外，该病的发病率随着饲养管理变化而变化，一般情况下，饲养管理条件差的牛场子宫炎发病率高于饲养管理规范的牛场。【前人研究基础】集约化奶牛场子宫炎的发病率一般是10 %～30 %，个别牛场可以达到40 %，甚至60 %～70 %[1-4]。研究表明，引起奶牛子宫炎的因素很多，归纳起来主要是由细菌、真菌和病毒等致病菌引起的感染。其中，奶牛子宫炎大多是由细菌感染而引起的。奶牛子宫炎是奶牛常见多发性疾病，长期的滥用抗生素导致大量的耐药菌株的出现，给治愈奶牛子宫炎的工作带了巨大障碍，为奶牛养殖业带来巨大经济损失。由于奶牛子宫炎病原菌分布具有一定区域特征[5]。【本研究切入点】为深入了解石河子垦区集约化牛场奶牛子宫炎主要致病菌分布和感染情况，制定相应的应对治疗措施，能够起到奶牛养殖过程中节约成本，提高效益的目的。2014年12月至2016年3月，对石河子垦区4个集约化奶牛场的103头患有子宫炎的奶牛进行取样研究，子宫内取样206份，带回实验室进行细菌的分离鉴定。以便能为石河子垦区防控奶牛子宫炎提供数据支持和参考价值[6]。【拟解决的关键问题】通过对石河子垦区规模化养殖的奶牛采集的样本进行分离、鉴定，研究石河子垦区集约化奶牛场子宫炎的发病情况，根据病原菌的鉴定了解子宫炎的感染情况和类别，为石河子垦区奶牛子宫炎的治疗提供理论依据和技术指导。

1 材料与方法

1.1 试验动物

奶牛由石河子垦区规模化牛场A场、B场、C场和D场提供，4个牛场根据子宫炎发病情况，共计采集样本数103头，采集样本数206份。

1.2 采样器具及仪器设备

子宫内取样器(专利号：ZL201420335941.6)，该取样器包括灭菌硬塑料外套和灭菌软塑料外套；VITEK-2全自动生化检定仪；精控恒温培养箱；经灭菌的EP管；灭菌生理盐水。

1.3 细菌培养基

按配制说明配制普通营养琼脂培养基、麦康凯培养基、血琼脂培养基，购自杭州微生物试剂有限公司。

制法：将准备好的培养基，加蒸馏水1000 mL，经120 ℃，灭菌15 min。待冷却至45～50 ℃，加入绵羊鲜血5～10 mL，摇匀倒平板，放入无菌培养箱，备用。

1.4 采样

经过育种员确诊或配种超过3次以上没有妊娠的奶牛视为患有子宫炎的奶牛，将奶牛引入保定架，站立保定，先用0.3 %的K2MnO4消毒后驱及阴部，然后将无菌的子宫内取样器，伸入阴道内，通过直肠把握法将取样器送入子宫内，尽量使取样器的取样球贴合子宫内膜，轻轻刮下内膜后，将取样器轻轻取出至阴门处，助手将准备好的无菌EP管打开，将取样头迅速放入EP管，剧烈摇晃数次后，将EP管盖好盖子放置于泡沫盒内(放冰袋)，准备采集下一份样本。先采集一侧子宫角内的样本，再采集另一侧子宫角内的样本。待样本采集完后，送入实验室进行细菌培养。在采样过程中尽量避免交叉污染，保证样本的准确性。

1.5 细菌的分离培养及染色镜检

当天采样结束，立即将样本带回实验室培养。将所有样本外部消毒后放入无菌操作台，用灭菌环或灭菌棉签，粘取样本分别均匀涂布于事先准备好的培养基平板。按常规方法进行细菌的分离培养。

将分离出的细菌先进行染色进行革兰氏染色，并在油镜下检查，鉴定细菌属于哪一类菌属。

生化鉴定：VITEK-2全自动生化检定仪的使用程序进行。其仪器设备工作原理是根据微生物学不同生化表型特性，运用数值分类原理对细菌的生化反应的表型特征，进行系统综合分析得到细菌的种、型及亚种、亚型等[5,7]。

2 结果与分析

2.1 采集样本的细菌分离鉴定

对103头牛206份样本子宫内分泌物进行细菌的分离鉴定，从206份样本中检出8种408个菌株。葡萄球菌占48.53 %(198/408)；链球菌占25.49 %(104/408)；大肠杆菌占20.83 %(85/408)。导致奶牛子宫炎病菌的分布以葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌为主，所占比例高达94.85 %(表1)。

2.2 致病菌感染情况

从表2可以看出，单一致病菌引起的子宫炎较少，大多数的奶牛子宫炎都是有2种以上致病菌引起，有的甚至3种以上。从分离结果可以看出奶牛子宫炎混合感染的情况较为严重。

表1 奶牛子宫炎主要致病菌分离鉴定结果

Table 1 Isolation and identification of the main uterine pathogenic bacteria of cow

致病菌名称 The pathogenic bacteria菌株数Number of strains所占百分比(%)Percent合计(%)Total金黄色葡萄球菌11227.4548.53表皮葡萄球菌8621.08无乳链球菌338.0925.49化脓链球菌5012.25乳房链球菌215.15大肠杆菌8520.8320.83变形杆菌133.193.19沙门杆菌81.961.96总计408100100

表2 奶牛子宫炎致病菌感染情况

2.3 微生物生化鉴定

根据病原菌染色、镜检形态学鉴定结果，将其分为3类：革兰氏阳性菌G+、革兰氏阴性菌G- 和链球菌。依据参阅文献[8-11]综合判断各类致病菌所需要做的生化鉴定指标(表3)。病原菌的最终结果，依据菌落特征、染色镜检、形态特征和生化鉴定结果进行综合评定[12]。

3 讨 论

感染奶牛子宫炎的病原菌较为复杂，不同地域、不同季节以及不同感染阶段所分离到的病原微生物的种类和比例同样存在差异。在黑龙江地区分离到的致病菌主要有葡萄球菌、大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌、链球菌、棒状化脓杆菌、沙门氏菌等；吉林地区分离到金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、化脓链球菌、兽疫链球菌、变形杆菌、肺炎球菌、类产碱杆菌、表皮及腐生葡萄球菌、肾棒状杆菌、蜡样芽孢杆菌、枯草杆菌等；兰州地域分离到化脓链球菌、大肠杆菌、乳链球菌、绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌等。也有报道认为奶牛子宫炎由非感染性因素引起[13]。国外研究者报道认为奶牛子宫炎与隐秘杆菌属细菌感染有关[14]。Donofrio and Fábián认为牛疱疹病毒亦可引起牛的子宫炎[15-16]。笔者分离到石河子垦区奶牛子宫炎主要致病有葡萄球菌、大肠杆菌、链球菌和蜡样芽胞杆菌。在本批次病原菌的分离中，以葡萄球菌和大肠杆菌检出率较高。这与一些省份的研究报道不尽一致，主要与地域、环境、用药以及其他因素造成。

表3 各类菌种所需做的生化鉴定试验[12]

因此，做好本地域内的病原菌的分离鉴定对生产意义重大。

从奶牛子宫炎患牛子宫采集的样本，进行细菌的分离鉴定来看，石河子垦区奶牛子宫炎以混合感染为主。这与赵红琼等[17]、黄璐等[18]、张义冉等[19]、陈星等[20]、郭素风等[21]所报道的奶牛子宫炎以单一菌种感染为主的结果相反。但与欧肇林等[22]对百色市30头患有子宫炎的奶牛进行了细菌的分离鉴定，发现百色市奶牛子宫炎以葡萄球菌和链球菌混合感染病例较多占总感染率的63.2 %的结果一致。与王国卿[23]对哈尔滨市养殖小区采集子宫内样本，进行细菌的分离鉴定，得出结论为本地奶牛子宫炎混合感染占90 %，单一感染占10 %的结果一致。出现这样的结果可能与不同地域微生物的区域分布、季节环境和抗生素使用习惯等因素有关。另一方面可能与采集样本的这4个牛场建场早，奶牛的饲养周期长有关。

表4 菌株的生化试验

注：㈩：产酸产气；+：产酸；㈩/-：不确定；-：不产酸不产气。

奶牛子宫炎致病菌在地域分布上有所不同，选择适宜的药物进行治疗可以起到事半功倍的疗效。除此之外，奶牛产后一段时间体况处于负营养阶段，机体抵抗力差、免疫力低下，环境中的病原微生物就会“趁虚而入”侵入动物机体而引发相应的疾病。因此，除了采取必要的措施进行积极治疗和预防之外，还应加强奶牛产后保健及饲养管理工作。同时，扎实做好本地区奶牛子宫炎主要致病菌的分离鉴定工作，对预防和治疗奶牛子宫炎具有重要意义。

4 结 论

通过对石河子垦区规模化奶牛养殖场奶牛子宫内取样，分离、鉴定引起奶牛主要致病菌的情况分析。在实验室共分离出8种病原菌408株，其中葡萄球菌198株(占48.53 %)、链球菌109株(占25.49 %)、大肠杆菌85株(占20.83 %)。从感染数据看，石河子垦区奶牛子宫炎以混合感染为主。