菜心抗虫性的cDNA-AFLP分析

康红卫,史卫东，罗海玲，周建辉，踞茜茜，张 力，农贵雄

(1．广西农业科学院蔬菜研究所，广西 南宁 530007；2.广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，广西 南宁 530007)

【研究意义】广西具有独特的温光资源、大量的冬闲田及冬闲劳动力资源，发展蔬菜生产占有得天独厚的条件，是国家“南菜北运”重要基地，是粤港澳等地的“后菜园”，也是对东盟地区出口外销蔬菜的生产大基地和运输大通道。广西气候温和，有利于蔬菜生产，但同时也利于病虫害发生。其中小菜蛾每年繁殖17～20代，危害十分严重，因此，开展菜心抗虫性研究，对广西蔬菜抗虫品种选育及食品安全均具有非常重要的生产意义[1-2]。【前人研究进展】cDNA-AFLP是一种结合AFLP和mRNA差异显示技术的分子标记，具有重复性好、假阳性低、多态性高、通用性好、无需基因组信息、准确反应基因差异表达和转录组信息等优点[3-4]，广泛应用于植物转录图谱的构建和抗病虫相关基因的检测和分离。在马铃薯上利用cDNA-AFLP标记构建转录图谱的研究表明，与基因组标记相比，转录组标记可以作为遗传标记用于构建遗传图谱，不在染色体特定区域簇集，cDNA-AFLP标记在转录激活区域富集，cDNA-AFLP标记是由转录本的DNA多态性标记产生的，在分子标记辅助育种、遗传分析和图位克隆上很有潜力[5]。在木薯利用cDNA-AFLP分析获得了一对亲本的500 多个TDFs，利用部分TDFs进行遗传图谱构建，结果表明TDFs比随机cDNA多态性更多[6]。在棉花上利用cDNA-AFLP剖析棉纤维发育次生壁加厚期基因表达谱和转录组图谱，结果获得大量与棉纤维基因相关基因[7]，在利用171个株系的棉花永久F2群体构建的转录组图谱上，可以通过环境变量鉴定出来与产量和产量组成性状QTL，相关分析表明TDFs与杂种的产量和产量杂种优势相关，这些TDFs是潜在的功能基因，对分子标记辅助选择非常有价值[8]。在白菜类蔬菜上，以矮脚黄白菜和白蔓菁芜菁自交系的杂交组合，构建含164个cDNA-AFLP 标记的转录图谱分布在13个连锁群上[9]，以抽薹极迟和极早的菜心为亲本获得的F2作图群体的转录组图谱，67个cDNA-AFLP 标记分布在4个连锁群上，为抽薹相关基因定位、比较基因组学研究和克隆提供重要的参考信息[10]。此外，cDNA-AFLP技术也广泛应用于植物抗虫性研究，在拟南芥[11]、马铃薯[12]、甜菜[13]、苹果树[14]和茶树[15]等作物上已有较多相关研究，黄家保等[16]利用新一代测序技术分析小菜蛾取食菜心后的 mRNA 表达变化，发现大量编码转录因子、激酶和蛋白的基因被诱导表达，涉及多种胁迫反应途径。【本研究切入点】本研究团队前期研究利用EST-SSR分子标记初步进行了菜心抗小菜蛾的抗性遗传分析[17]，抗虫菜心群体连锁遗传规律及抗虫分子机制还存在高密度转录图谱构建及抗性相关基因未知等问题，而利用cDNA-AFLP技术从转录组水平上分析抗虫菜心群体的连锁遗传规律及抗虫分子机制目前尚未见相关研究报道。【拟解决的关键问题】拟利用cDNA-AFLP标记技术构建转录图谱、分析差异基因表达，筛选和克隆抗虫相关转录衍生片段，从转录组水平上分析抗虫性的分子遗传规律，旨在从转录组水平探讨菜心抗虫性的分子机制，为抗虫品种选育和抗虫基因挖掘提供理论支持和中间材料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

于2013-2016年在广西农业科学院蔬菜研究所科研基地开展试验，将抗小菜蛾品种Caixin65和感小菜蛾品种Caixin69的杂交， F1自交，将96个F2单株及2个亲本用于分析。在齐口期采集叶片，立即置于液氮中，并转移至-80 ℃低温冰箱保存。主要试剂：pMD18-T Simple Vector、大肠杆菌(Escherichia coli)DH 5α 感受态细胞、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs和DNA marker均购置于TaKaRa 公司(大连)；SuperScriptTM Ⅲ First-Strand Synthesis System for RT-PCR 反转录试剂盒、TRIzol 试剂盒、RNase H 、DNA Polymerase 和DNA Ligase均购置于Invitrogen 公司(美国)；琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒购置于天根生化科技有限公司(北京)。琼脂糖、聚丙烯酰胺、甲叉双聚丙烯酰胺、硝酸银、氢氧化钠、硫代硫酸钠、冰醋酸和甲醛均购自生工生物工程(上海)股份有限公司。cDNA-AFLP的接头及引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 菜心RNA提取及cDNA-AFLP分析

菜心Total RNA 的提取采用TRIzol 试剂并按照说明书进行，应用SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒说明书步骤合成cDNA 第1链。反应体系(10 μl)：1 μl 3′ RACE Adaptor (5 μmol/μl)，2 μl 5×Buffer，1 μl dNTP 混合物(10 mmol/L)，0.25 μl RNase Inhibitor (40 U/μl) ，5.5 μl 总RNA (1 μg/μl) 和0.25 μl M-MLV (200 U/μl)反转录酶。混匀后在42 ℃放置60 min 后合成cDNA 第1 链。第2链cDNA合成反应体系：10 μl buffer2(10×)，5 μlE.coliDNA Polymerase，1.5 μlE.coliDNA Ligase，1 μl RNaseH，3 μl dNTP(10 mmol/L)，20 μl第1链cDNA产物，补充超纯水至100 μl，16 ℃反应2.5 h，80 ℃ 15 min灭活酶活性；加入4 μl的T4DNA Polymerase，37 ℃反应10 min。EcoRⅠ、MseⅠ酶切及连接体系：含cDNA 模板4 μl DNA(50 ng/μl)，接头Adapter 1 μl，限制性内切酶EcoRⅠ/MseⅠ2 μl，10×Reaction Buffer 2.5 μl，10 mmol/L ATP2.5 μl，T4连接酶1 μl，ddH2O 7 μl。37 ℃保温5 h，8 ℃保温4 h，4 ℃过夜。预扩增反应体系(25 μl)：连接产物 3.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 2.0 μl，EcoRI预扩增引物 (10 μM) 1.4 μl，MseI 预扩增引物 (10 μM) 1.3 μl，TaqDNA 聚合酶0.3 μl，补充RNase free ddH2O至25 μl。反应程序：预变性94 ℃ 2 min；94 ℃变性30 s，50 ℃复性30 s，72 ℃延伸80 s，扩增30 轮，72 ℃延伸5 min。预扩增产物用0.1×TE 按1：20 稀释作为模板。选扩增反应体系(25 μl)：预扩增稀释产物(1 ng/μl)3.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.5 μl，EcoRⅠ选扩增引物(10 μM)1.0 μl，MseⅠ选扩增引物(10μM)1.0 μl，TaqDNA 聚合酶(1 U/μl) 0.2 μl，RNase free ddH2O补充至 25 μl。反应程序：94 ℃变性30 s，65 ℃复性30 s，72 ℃延伸80 s，扩增14 轮，每轮退火温度降低0.7 ℃；94 ℃变性30 s，50 ℃复性30 s，72 ℃延伸80 s，扩增循环23 轮；72 ℃延伸5 min。电泳检测：选择性扩增产物通过6 %的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，硝酸银溶液快速染色，拍照分析条带差异情况，然后自然干燥保存。接头和引物序列见表1。

1.3 差异片段的回收、克隆以及测序

将非变性PAGE胶板上的差异片段用刀片割下放入200 μl PCR管子中捣碎，加入20 μl ddH2O，95 ℃保温5 min，自然冷却。取 2 μl 上清液为模板，以获得差异表达条带的引物和扩增条件进行二次 PCR 扩增。反应体系：上清液2.0 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，MgCl2(25 mmol/L) 1.5 μl，dNTPs(2.5 mmol/L) 1.5 μl，EcoRⅠ选扩增引物(10 μM)1.0 μl，MseⅠ选扩增引物(10 μM)1.0 μl，TaqDNA 聚合酶(1 U/μl) 0.2 μl，RNase free ddH2O补充至 25 μl。反应程序：94 ℃变性30 s，65 ℃复性30 s，72 ℃延伸80 s，扩增14 轮，每轮退火温度降低0.7 ℃；94 ℃变性30 s，50 ℃复性30 s，72 ℃延伸80 s，扩增循环23 轮；72 ℃延伸5 min。取 50 μl二次扩增 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，紫外光下回收PCR 产物。用天根琼脂糖胶回收试剂盒纯化回收的片段，将目的片段连接到克隆载体pMD18-T上，转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑选克隆送生工生物工程(上海)有限公司测序。

表1 用于 cDNA-AFLP 分析的接头、预扩增和选择性扩增的引物序列

Table 1 Adaptors and primer pairs used for cDNA-AFLP analysis

1.4 AFLP分子标记的统计与分析

非变性聚丙烯酰胺凝胶板上，每条扩增条带均作为一个分子标记，记为“1”，未出现扩增带记为“0”，而对于一些模糊不清，难判读或由于其他原因使数据缺失的带型则记录为“-”，以此作为数据记录的标准。

1.5 cDNA-AFLP转录图谱构建

利用获得的F2群体的cDNA-AFLP标记进行连锁分析，对分离数据进行适合性测验，用符合1∶1 分离比例的标记构建连锁图谱。运用 JoinMap 4. 0 软件构建分子遗传图谱，先用“New Project”命令创建一个新的文件夹，“Load data”命令导入标记数据，再用命令“Individual genot freq”排除缺失数据过多的单株，用“Locus genot freq”命令分析标记的偏分离情况，然后用 Group 命令进行分组，最后用 Map 命令构建分子遗传图谱，采用 Kosambi 函数计算图距。

1.6 差异片段序列分析

克隆序列首先利用Cap3拼接，然后利用Brassica Database(http://brassicadb.org/brad/)数据库进行BLAST同源性比对分析，通过Clustal (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)比对序列结构差异，利用NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在线程序的邻接法(Neighbor-joining，NJ)构建系统发育进化树，利用STRING在线数据库(https://string-db. org/cgi/input.pl)检索TDFs的蛋白质功能信息。

表2 cDNA-AFLP标记在菜心F2代的多态性水平

2 结果与分析

2.1 cDNA-AFLP标记的多态性

一共选择了14对引物组合进行cDNA-AFLP分析。不同引物组合的标记在菜心F2群体中显示出较高的多态性，14对引物组合共扩增出330条扩增带，其中238条为多态性带，多态性条带比例为56.00 %～100.00 %，平均为73.86 %，平均每对引物扩增24条带，多态性条带17个(表2)。结果表明cDNA-AFLP具有非常高的多态性，适合菜心差异基因表达研究。

2.2 cDNA-AFLP转录图谱构建

对分离数据进行适合性测验，用符合1∶1 分离比例的标记构建连锁图谱(图1)。本研究使用 JoinMap 4.0 软件构建的转录图谱由5个连锁群组成，193个标记未能定位在连锁群上，42个位点定位在 5个连锁群上，总长度为575.869 cM，平均图距为 115.1738 cM。每个连锁群上的标记数为2～23个，平均为8个，5个连锁群的LOD值变化范围为9.923～12.710，平均为13.207。A1连锁群上的分子标记分布不均匀，成簇分布和出现了5个较大的断裂。42个作图位点中，共有18个偏分离位点，偏分离比例为42.86 %，其中11个偏向母本，偏分离比例为为26.19 %，7个偏向父本，偏分离比例为16.67 %(表3)。在330个位点中，异常分离位点(父母本没有，子代有)103个，占总位点数的34.24 %。菜心F2群体存在显著的偏分离现象。

2.3 cDNA-AFLP差异片段的分离、克隆和测序分析

选取表达量较高的差异表达位点进行回收和PCR 验证，将阳性克隆进行双向测序，经Cap3拼接获得 10个TDF差异片段(表4)。利用DNAMAN和Brassica Database进行同源性比对，搜索与菜心TDF相关信息，检索NCBI和sting获得功能信息。

利用DNAMAN进行同源性比对，结果表明10条TDF的相似性只有53.55 %，表明差异表达片段之间具有不同的核苷酸片段或者碱基的插入或缺失，这也是cDNA-AFLP多态性产生的分子基础。将TDF序列比对并利用Clustal Omega构建系统发育树，发现1个TDF5-1-1与防御相关基因GW775571.1具有高度的序列同源性，8个TDF与大白菜花蕾败育相关基因GR308173.1高度同源，1个与功能未知基因EX106546.1高度的序列同源(图2)，结果表明，同为十字花科植物，菜心自成一类，但菜心与白菜(Brassicarapa)、白菜类蔬菜(B.campestris)、甘蓝型油菜(Brassicanapus)、甘蓝(Brassicaoleracea)、芥菜(Brassicajuncea)、萝卜(Raphanussativus)、荠蓝(Camelinasativa)、荠菜(Capsellabursa-pastoris)和拟南芥(Arabidopsislyrata)等十字花科植物仍然具有较近的亲缘关系。

表3 cDNA-AFLP转录图谱连锁群的基本特征

图1 菜心F2群体cDNA-AFLP 分子转录图谱Fig.1 Transcriptome map of cDNA-AFLP markers with F2 population of flowering Chinese cabbage

3 讨 论

3.1 cDNA-AFLP标记在菜心F2群体后代中的多态性水平

本研究选用14对引物组合进行cDNA-AFLP分析，平均每对引物扩增24条带，多态性条带17个，14对引物多态性条带比例为56.00 %～100.00 %，平均为73.86 %，表明非变性聚丙烯酰胺凝胶的显示带数较少，但cDNA-AFLP仍具有较高的多态性，高于利用EST-SSR多态性结果[17]，表明cDNA-AFLP适合菜心差异基因表达研究。

表4 TDFs的同源性比对分析和功能分类

菜心(Brassica rapa var. parachinensis)：TDF5-1-1；白菜(Brassica rapa)：KY363864.1、AY395720.1、XM009140795.2、AB325668.1、XM009107912.2、XM009140796.2 、XM009140794.1 和AC232439.1；白菜类蔬菜(B.campestris): X77990.1；甘蓝型油菜(Brassica napus):XM013886724.1、XM013889820.1、XM013886725.1、XM013886720.1；甘蓝(Brassica oleracea)：XM013780571.1、EF484879.1、XM013747937.1、XM013747935.1、XM013747933.1；芥菜( Brassica juncea)：DQ359126.1；萝卜( Raphanus sativus):、XM018603280.1、XM018603273.1、XM018611175.1；荠蓝(Camelina sativa)：XM010518038.2；荠菜(Capsella-rubella):XM006302428.1；拟南芥(Arabidopsis lyrata)：XM002878094.2图2 菜心TDF同源序列的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of TDF homologous sequences from plants

3.2 cDNA-AFLP转录图谱分析

EST-SSR是共显性标记，来自于转录区，具有通用性好、保守性高及连锁相关性状等特点[18-19]，其对菜心抗小菜蛾F2群体的检测结果应该更符合群体特征[15]，但是因为开发的菜心EST-SSR标记较少，未能揭示内含子、调控序列等基因表达调控信息，在高密度图谱构建和基因克隆方面还有不足。为此，本研究利用330个cDNA-AFLP标记构建对菜心抗小菜蛾的转录图谱，但只有42个位点定位在 5个连锁群上，一共有18个偏分离位点，偏分离比例为42.86 %，偏向母本的比例为26.19 %，偏向父本的比例为16.67 %。与已有的菜心、白菜和甘蓝型油菜的研究相比，本研究的菜心偏分离比例居中。在玉米[26]、水稻[27]、高粱[28]、大豆[29]等作物的分子标记连锁群上都发现了偏分离的热点区域。热点区域中的偏分离标记大多偏向父本，表明雄配子体的选择可能是偏分离形成的主要原因，在水稻中和玉米中定位了不同的配子体基因[30]。在大豆重组自交系、甘蓝型油菜重组自交系和DH 群体中则发现多数的偏分离标记偏向母本[25,29,31]。本研究利用F2分离群体发现标记偏向母本的比例较高，与利用菜心RIL群体得到的偏向父本的结果不同[20]，这是否与群体或标记的不同有关，或是母本对偏分离的影响较大还需要继续研究。不同标记类型得到的偏分离比例和程度差异很大，偏分离位点对共显性标记间重组率估计的影响小于显性标记[32]，AFLP 和RAPD 标记经常在着丝粒和异染色质附近区域存在聚集现象，从而造成连锁群上出现很大的空隙[33-34]，这也可能是本研究利用cDNA-AFLP标记构建的连锁群上标记分布不均匀，成簇分布和具有较大的断裂原因。本研究结果也意味着对于遗传偏分离比例较高的菜心，可能将cDNA-AFLP标记和SSR标记结合会构建出高精度的图谱。显著的偏分离现象，可能对抗/感株系的筛选也具有指导意义。

3.3 抗虫相关基因分析

β-1,3-葡聚糖酶是一类以基因家族形式存在的重要病程相关蛋白(Pathogenesis-related proteins, PR, PR2)，是植物的重要防御基因。GW775571.1是从生长3周的白菜叶片获得的表达序列标签，为白菜霜霉病诱导的防御相关基因cDNA 5端 mRNA序列，全长222 bp，在白菜和小麦抗病防御反应中发挥作用[35-38]。此外，GW775571.1与Brassicarapaglucanendo-1,3-beta-glucosidase(XM_009140795.2)和Brassicarapasubsp.chinensisBcGlugeneforbeta-1,3-glucanase(AB325668.1)的同源性达100.00 %，与Brassicarapabeta-1,3-glucanase(KY363864.1)同源性达99 %，与拟南芥Arabidopsislyratasubsp.lyrataglucanendo-1,3-beta-glucosidase(XM_002878094.2)同源性为84 %。与甘蓝型油菜、甘蓝、萝卜等也具有高度同源基因(图2)。与拟南芥(Arabidopsisthaliana)putative beta-glucosidase高度同源[16]。本研究克隆的TDF5-1-1差异表达片段与白菜病程相关蛋白2基因GW775571.1同源性高达98 %，意味着抗虫性相关基因可能与抗病性基因有关，但还需要后续实验验证。

cDNA-AFLP分子标记来自mRNA，单拷贝和多拷贝都有[5]，本研究8个差异片段(TDF4-2-1、TDF4-3-1、TDF5-2-1、TDF5-3-1、TDF6-1-1-1、TDF6-1-2-1、TDF6-2-2-1和TDF6-2-1-1)均是大白菜花蕾败育相关基因(GR308173.1)相关序列[39]，是否是克隆的多拷贝片段还有待继续研究，花蕾败育相关基因是否参与抗虫性有关还未见报道，TDF4-1-1 与EX106546.1高度同源，功能未知。

4 结 论

本研究利用cDNA-AFLP 分析菜心抗虫性，利用42个位点构建了包含5个连锁群的cDNA-AFLP转录图谱，获得1个TDF与白菜防御相关基因GW775571.1高度同源，8个TDF与大白菜花蕾败育相关基因GR308173.1高度同源，1个TDF与功能未知基因EX106546.1高度同源。本研究初步揭示了转录组水平上抗虫菜心群体的连锁遗传规律及抗虫性的分子机制，为高密度遗传图谱构建及抗虫基因全长的克隆和验证、抗/感材料的筛选和进化研究具有指导意义提供理论指导。