丁苯酞联合甘露醇对弥漫性脑损伤大鼠咬合蛋白及基质金属蛋白酶-9表达的影响

刘俊杰 赵宏涛 冯思国 王婧瑶 梁文吉 王一超 李建民 赵雅宁 徐继伟

(华北理工大学，河北 唐山 063000)

弥漫性脑损伤(DBI)具有较高致死率，主要死因为创伤后广泛性脑水肿，急性的脑水肿导致脑组织体积增大，颅内压增高，甚至引起脑疝，是急性DBI后致死的主要原因〔1〕。目前临床主要使用甘露醇行脱水治疗来降低颅内压，但有研究报道大剂量应用甘露醇会导致肾衰竭等〔2〕。丁苯酞是我国自行研制的拥有自主知识产权的国家一类新药，可通过提高脑血管内皮一氧化氮(NO)和前列腺素(PG)I2的水平〔3〕，降低细胞内钙浓度、抑制谷氨酸释放及降低花生四烯酸的含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等机制阻断急性脑损伤的多个病理环节，从而发挥较强的抗脑缺血作用，丁苯酞联合甘露醇对脑损伤的治疗国内鲜有报道。咬合蛋白是脑微血管紧密连接的主要成分，与脑水肿形成的关系密切〔4〕。基质金属蛋白酶(MMP)-9是一种水解细胞外基质的蛋白裂解酶〔5〕，可攻击脑血管外基膜的层黏蛋白和纤黏蛋白，破坏血脑屏障，也与脑水肿形成密切相关。本实验观察丁苯酞与甘露醇联合应用对DBI脑水肿及咬合蛋白、MMP-9表达的影响，旨在探讨丁苯酞对弥漫性脑损伤大鼠的脑保护机制及丁苯酞与甘露醇合用的效果。

1 材料与方法

1.1材料与分组 清洁级成年雄性SD大鼠240只，平均体重(300±20)g，购自北京维通利华公司〔合格证：SCXK(京)2002-003〕，饲养于河北联合大学实验动物中心，动物自由进食进水。动物房每天光暗交替，相对湿度55%，温度22℃，常规饲料喂养。所有动物实验遵循国际生命指导中心和使用动物实验原则。按随机数字法分为模型组(n=80)，甘露醇组(n=80)，丁苯酞+甘露醇组(n=80)。每组又根据3 h、12 h、24 h、72 h、144 h分成5个亚组。

1.2DBI模型的建立 参考Marmarou等〔6〕的自由落体打击大鼠法制作创伤性脑损伤模型：术前12 h大鼠禁食水，乙醚麻醉70～150 s，将麻醉好的大鼠俯卧于固定的海绵床垫(10 cm×20 cm×30 cm)上，用一直径1.9 cm、质量为450 g 的铜制圆柱从1.5 m高度垂直落下撞击大鼠颅骨冠状缝与矢状缝交点处的不锈钢垫，制造DBI大鼠模型。

1.3给药方法 甘露醇组和丁苯酞+甘露醇组大鼠腹股沟区消毒备皮，在严格无菌的条件下，在下肢根部作一与腹股沟平行的切口，找到股静脉。在显微镜下以1 ml注射器穿刺股静脉，造模成功后10 min按1.0 g/kg体重静注甘露醇。静注完毕后缝合切口。丁苯酞+甘露醇组在大鼠致伤后10 min 给予丁苯酞软胶囊植物油溶液(0.1 g/ml) 0.4 ml/kg灌胃，1次/d，直至各时间点处死。模型组及甘露醇组在相同时间内给予等量植物油0.4 ml/kg。

1.4脑组织含水量测定 随机选取3组模型中各时间点大鼠各5只，用10%水合氯醛深度麻醉后，处死取脑，取200 mg左右损伤灶周围脑组织，应用MA110电子分析天平(上海第二天平仪器厂)称取脑组织湿重并且记录后将组织放置于105℃恒温干燥箱内干燥48 h至恒重，称其干重后按Elliot公式计算脑含水量：脑含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.5脑血管通透性测定 随机选取3组模型各时间点大鼠4只，制作伊文思蓝标准曲线，据此测定脑组织的伊文思蓝含量(μg/g湿重脑组织)。方法：从尾静脉以2 ml/kg的量注入2%伊文思蓝，2 h后10%水合氯醛麻醉、采用生理盐水心内灌注后断头取脑，称取双侧大脑皮质湿重后置于甲酰胺(1 ml/100 g脑组织)中，60℃温水孵育24 h。1 000 r/min离心机上离心5 min，采用分光光度计(λ=632 nm)测定上清液吸光度(A)值，根据标准曲线计算出伊文思蓝含量。

1.6免疫组织化学检测脑组织咬合蛋白及MMP-9的表达 随机选取3组各时间点大鼠各5只，10%水合氯醛深度麻醉后开胸，4%多聚甲醛灌注，断头取脑，4%多聚甲醛溶液中4℃冰箱过夜至组织块沉底，冠状位切取2 mm组织块，浸于4%多聚甲醛再固定4 h。切片经流水冲洗，脱水透明，石蜡包埋。连续切片，片厚5 μm。取各大鼠同部位切片3张，脱蜡至水，3%过氧化氢室温孵育10 min，高压热修复，滴加咬合蛋白一抗(1∶100，美国Santa Cruz 生物技术公司)4℃过夜，磷酸盐缓冲液冲洗，滴加二抗(辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，1∶2 000，武汉博士德生物工程有限公司)，37℃孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色。

1.7Western印迹检测脑损伤周围皮层咬合蛋白和MMP-9表达的变化 大鼠处死后，冰上迅速取脑，使用细胞裂解液分别提取各组各时间点大鼠损伤区周围脑组织总蛋白，考马斯亮蓝法测定蛋白含量，上样量为100 μg。15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离后，硝酸纤维素(NC)转膜，再经5%脱脂奶粉封闭; 山羊抗咬合蛋白多克隆一抗(1∶1 000倍稀释) 、山羊抗MMP-9多克隆一抗(1∶1 000倍稀释)、山羊抗 actin多克隆一抗(1∶1 000倍稀释)，4℃孵育过夜，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶1 000倍稀释) 室温孵育。电化学发光法(ECL)显色。采用数码成像分析系统软件进行定量分析。

1.8统计学方法 应用SPSS13.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1各组脑组织含水量和伊文思蓝含量比较 甘露醇组脑组织含水量较模型组明显下降(P<0.05)。丁苯酞+甘露醇组脑组织含水量较甘露醇组明显下降(P<0.05)。其中3 h脑组织含水量开始增加，12 h继续增加，24 h达到高峰，72 h脑组织含水量开始下降，144 h脑组织含水量明显下降。甘露醇组血管通透性较模型组明显降低(P<0.05)，丁苯酞+甘露醇组血管通透性较甘露醇组明显降低(P<0.05)。其中3 h血管通透性开始增加，12 h继续增加，24 h达到高峰，72 h开始下降，144 h明显下降。见表1、表2。

表1 各组脑组织含水量比较

与模型组比较：1)P<0.05；与甘露醇组比较：2)P<0.05；与本组前一时间点比较：3)P<0.05，下表同

表2 各组皮质区伊文思蓝含量比较

2.2各组脑组织MMP-9免疫组化结果比较 模型组各时间点损伤区周围都可见大量被染成棕黄色的阳性细胞，包膜表达，甘露醇组阳性细胞数在3 h、12 h较模型组有明显减少(P<0.05)，而在24 h、72 h、144 h无明显差异(P>0.05);丁苯酞+甘露醇组阳性细胞较甘露醇组明显减少(P<0.05)。其中伤后3 h MMP-9阳性细胞数开始加，24 h达高峰，72 h开始减少，144 h明显减少。见表3。

表3 各组脑组织MMP-9免疫组化结果比较

2.3各组脑组织咬合蛋白免疫组化结果比较 模型组各时间点损伤区域周围可见少量被染成棕黄色的阳性细胞，细胞核表达。与模型组相比，甘露醇组大鼠损伤区周围阳性细胞数在伤后3 h明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)，而在伤后12 h、24 h、72 h、144 h差异无统计学意义(P>0.05);与甘露醇组相比，丁苯酞+甘露醇组损伤区域阳性细胞数明显增多(P<0.05)。其中伤后3 h咬合蛋白阳性细胞开始减少，24 h减少最为明显，72 h开始增加，144 h明显增加。见表4。

表4 各组脑组织咬合蛋白免疫组化结果比较

2.4各组脑组织MMP-9 Western印迹结果比较 与模型组大鼠相比，甘露醇组在伤后3 h、12 h损伤区域MMP-9的含量明显减少(P<0.05)，而在伤后24 h、72 h、144 h无明显差异(P>0.05)；与甘露醇组相比，丁苯酞+甘露醇组各时间点损伤区域MMP-9的含量明显减少(P<0.05)。其中伤后3 h MMP-9含量开始增加，24 h减增加最明显，72 h开始减少，144 h明显减少。见表5。

表5 各组脑组织MMP-9 Western印迹结果比较

2.5各组脑组织咬合蛋白Western印迹结果比较 与模型组相比，甘露醇组在伤后3 h损伤区咬合蛋白含量明显增多(P<0.05)，其他时相没有明显差别(P>0.05)；与甘露醇组相比，丁苯酞+甘露醇组各时间点损伤区域咬合蛋白含量明显增多，差异有统计学意义(P<0.05)。其中伤后3 h咬合蛋白含量开始减少，24 h减少最为明显，72 h开始增加，144 h明显增加。见表6。

表6 各组脑组织咬合蛋白Western印迹结果比较

3 讨 论

脑水肿是颅脑损伤后主要继发性病理过程，也是其主要的致死因素。DBI可引起局部脑组织微循环障碍，缺血缺氧，甚至引起炎症反应、自由基损伤、血脑屏障通透性增高等病理过程，导致脑水肿形成〔7〕。脑水肿形成后可进一步加重脑组织缺血缺氧，并且可引起颅内压增高，甚至脑疝形成，明显加重患者症状，影响患者预后〔8〕。目前临床上常用甘露醇等高渗性脱水剂治疗脑水肿，其作用机制是①快速扩充血容量，降低血细胞比容和血液黏度，改善血液流变学，增加脑血流量和氧传递，使颅内压在几分钟内降低；②渗透压效应：通过渗透性脱水作用减少脑组织的含水量；③脑血管作用：在脑血流自动调节正常情况下，增加氧输送可以使局部脑组织中血管收缩；④可能具有清除自由基的作用〔9〕。本研究结果与此一致。Rafols等〔10〕研究结果显示，脑损伤后12～48 h脑血流减少近三分之一。丁苯酞可通过提高脑血管内皮NO和PGI2的水平，降低细胞内钙浓度，抑制谷氨酸释放，降低花生四烯酸含量，抑制氧自由基和提高抗氧化酶活性等机制阻断急性脑损伤的多个病理环节，具有改善微循环的作用〔11〕。我们推测，丁苯酞正是通过该机制减轻脑水肿，因此丁苯酞联合甘露醇较单纯应用甘露醇的效果要好。

MMP-9主要存在于脑组织的海马、皮质和纹状体中，但正常情况下含量很少〔12〕。本研究结果显示，伤后3 h损伤区皮层MMP-9表达开始增加，24 h达到高峰，72 h开始降低，144 h明显降低，与Lucivero等〔13〕的研究基本一致。甘露醇组在损伤早期较模型组损伤区周围皮质MMP-9含量有所下降，谷月〔2〕的研究显示，甘露醇只是高渗性脱水，并未直接影响MMP-9的代谢，脱水的速度可能会对MMP-9的含量产生影响。本文结果提示丁苯酞可减少损伤灶周围皮层MMP-9的表达。鄢学芬等〔14〕研究表明，丁苯酞具有减少损伤灶周围中性粒细胞数目、抑制白细胞介素(IL)-1和肿瘤坏死因子(TNF)-α表达的作用，而中性粒细胞是脑梗死后MMP-9的主要来源，而且MMPs的基因表达受IL-1等细胞因子的调控。我们推测丁苯酞可通过抑制该炎症反应过程，从而减少MMP-9的表达。而甘露醇并不能抑制该炎症反应过程。因此，丁苯酞联合甘露醇治疗要比单纯甘露醇治疗MMP-9的表达少。

咬合蛋白是血管内皮细胞紧密连接的重要组成部分，DBI患者咬合蛋白的表达明显减少，因此血管内皮细胞的紧密连接破坏，血管内皮细胞的通透性增加，脑水肿形成〔15〕。本研究结果显示，伤后3 h损伤去皮层区咬合蛋白表达开始减少，24 h达到最低，72 h开始回升，144 h明显回升。甘露醇组BDI大鼠模型损伤区域周围皮层咬合蛋白的含量在伤后3 h较模型组高，其他时相均无统计学差异，其机制尚不明确，国内外文献未见报道。我们推测，咬合蛋白的含量可能也与脱水的速度有关。丁苯酞联合甘露醇治疗DBI大鼠模型损伤区域周围皮层咬合蛋白的含量明显高于甘露醇治疗组。Gidday等〔16〕研究发现MMP-9可降解紧密连接中的咬合蛋白，从而破坏血脑屏障的功能，导致脑水肿的发生。Seth等〔17〕研究发现，细胞内钙离子浓度可通过调节咬合蛋白的丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸的磷酸化状态，来调节紧密连接的开合，进而影响血脑屏障的通透性。有学者研究〔18〕，颅脑损伤后神经细胞和血管内皮细胞结构破坏，钙通道大量开放，钙离子大量内流，进而通过咬合蛋白的调节破坏血脑屏障的通透性，加重脑水肿。我们推测丁苯酞可通过降低MMP-9的表达来减少对咬合蛋白的降解，或者通过减少细胞内钙离子的浓度来调节咬合蛋白的表达，减少对血脑屏障的破坏，进而减轻脑水肿的程度。因此，丁苯酞联合甘露醇组要比单纯甘露醇治疗脑水肿的程度要轻。