2型糖尿病大鼠肾组织NF-κB水平的变化

江思瑜 孙 霓 李金航 吴晓光

(承德医学院基础医学院，河北 承德 067000)

糖尿病(DM)肾病(DN)具有起病隐袭、进展缓慢、高致残致死率的特点，是发达国家慢性肾衰的首位病因〔1〕。目前已发现高血压、血液改变、氧化应激、炎症机制等参与了DN的形成，但对于DN发病的确切机制尚不完全清楚〔2〕。核因子(NF)-κB作为主要的转录因子之一，具有多向性，参与机体多种生理调节，如：细胞的增殖与凋亡、炎症、免疫等〔3〕。本研究旨在探究NF-κB在DN形成中所扮演的作用。

1 材料与方法

1.1材料 100只健康SD大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，高脂高糖饲料(北京博泰宏达生物技术有限公司)，链脲佐菌素(STZ)(美国Sigma公司)，兔抗鼠p50单克隆抗体(Santa Cruz公司)，二氨基联苯胺(DAB)试剂盒与SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2动物建模及分组 运用随机数字表法将100只SD大鼠分为正常组(NC组)与DM组，各50只，适应性喂养1 w。NC组饲喂正常饮食，DM组饲喂高脂高糖饮食4 w后，禁食禁水24 h，按30 mg/kg腹腔注射经缓冲液稀释的STZ，48～72 h后，大鼠尾静脉采血，连续3次所测空腹血糖(FBG)≥16.7 mmol/L，同时尿糖>()为模型建立成功准则，NC组则注射等量溶媒。

1.3实验方法 分别于建模成功后的2、4、8 w，称量大鼠体重(BW)后处死。处死大鼠前24 h开始收集代谢笼中大鼠尿液，甲苯防腐，混匀充分，300 r/min离心，取上清液检测24 h尿蛋白(UP)、尿糖。3.5%戊巴比妥麻醉下，于大鼠股静脉收集血液标本，300 r/min离心，取上清液分装，全自动生化仪检测血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)、血清白蛋白(ALB)水平。120 mmHg高压下，4℃生理盐水多次漂洗肾脏至苍白，4%多聚甲醛溶液灌注，摘取肾脏，酒精梯度脱水，石蜡包埋，制作成厚度5 μm石蜡切片。石蜡切片依次二甲苯脱蜡、酒精脱水、苏木精染色、盐酸乙醇漂洗、酒精脱水、伊红乙醇复染、酒精脱水、二甲苯透明进行常规HE染色，光镜下观察肾脏病理变化。石蜡切片依次脱蜡、水化、微波抗原修复、滴加兔抗鼠p50单克隆抗体为一抗(1∶50稀释)过夜、滴加二抗、链霉亲和素-生物素复合物(SABC)孵育、DAB显色、复染、脱水、透明。高倍镜下，随机选取每张切片阳性细胞表达区的5个视野，统计阳性细胞表达数，取平均值。

1.4统计学方法 应用SPSS19.0系统进行t检验、线性相关性分析。

2 结 果

2.1各组生长指标检测结果 DM组2、4、8 w 24 h UP、FBG、BUN、SCr均较NC组显著增高(P<0.05)，BW、血清ALB均较NC组显著降低(P<0.05)。见表1。

2.2各组肾脏结构变化比较 HE染色下，NC组各个时期肾脏结构无明显异常改变；DM组则均出现肾小球增大、基膜加厚、系膜扩增等病理变化，且随病程延长，病理变化愈加明显，在第8周，肾脏可见炎细胞浸润。见图1。

表1 各组生化指标检测结果

与NC组相比:1)P<0.05

图1 DM组肾脏改变(×400)

2.3SABC免疫组化法检测NF-κB表达 NF-κBp50在NC组各时期大鼠肾脏中表达较少，2、4、8 w肾脏细胞有NF-κBp50表达的细胞个数分别为(1.26±0.74)、(1.58±1.23)、(1.47±1.03)个，且在胞质表达多于胞核表达；NF-κBp50在DM组各时期肾脏内均有阳性表达，并呈上升态势，2、4、8 w肾脏细胞有NF-κBp50表达的细胞个数分别为(10.57±4.77)、(23.99±7.76)、(32.36±5.87)个，较NC组显著增多(P<0.05)。

2.4相关性分析 NF-κBp50在肾脏中的表达与24 h尿蛋白定量呈正相关(r=0.852，P<0.05)，与BUN呈正相关(r=0.715，P<0.05)，与血清ALB呈负相关(r=-0.689，P<0.05)。

3 讨 论

几乎所有的细胞内都含有NF-κB〔4〕。NF-κB是一种调控基因表达的蛋白家族，由五个亚型组成，共同拥有Rel同源区，根据反式激活结构域(TD)的有无分为两类〔5〕，一类有TD类：Rel(cRel)、RelB、p65(RelA，NF-κB3)；另一类无TD类：p50(NF-κB1)、p52(NF-κB2)。二元对称是NF-κB序列的结构特点，此特点决定了各个亚型必须发生二聚化，形成二聚体才可以发挥生物作用，最常见的二聚体是p50、p65二聚体〔6〕。当无刺激产生时，细胞处于静止，NF-κB的二聚体与NF-κB抑制因子(IκB)在细胞质内结合，处于无活性状态〔7〕；当受到外界刺激时，主要通过两种方式活化NF-κB，(1)经典途径〔6，8〕：IkBs经IkBs激酶(IKK)磷酸化自身两个特殊丝氨酸残基，随后结合SCF-E3泛素化连接酶，泛素化的IkBs与NF-κB二聚体解离，对NF-κB的抑制作用丧失，NF-κB活化，进入细胞核，与特定DNA序列结合，诱导基因转录；(2)非经典途径〔6，9〕：p105、p100分别是p50、p52的前体物质，除拥有p50、p52序列以外，还拥有IkB样锚蛋白区，此区参与对相应NF-κB的抑制，前体物质转变为p50、p52的机制尚不完全清楚，但这一过程中IKK-a和NF-κB诱导激酶所发挥的作用不可忽视。

UP、BUN、血清ALB等均可作为反映肾功能强弱的指标，推测NF-κBp50会对肾脏产生损害，并参与DN的致病。本文免疫组化结果与周谊霞等〔10〕结果相同。在李衍辉〔11〕的体外细胞培养研究中，同样发现高糖肾系膜细胞对NF-κB表达的影响呈现浓度及时间的依赖性。高糖环境所致的代谢异常可以诱导多种信号通路转导，刺激NF-κB激活因子生成，活化NF-κB表达〔12〕。以Toll样受体(TLR)4信号通路为例，高糖激活TLR4，刺激髓样细胞分化因子(MyD)88发生二聚化〔13〕，活化的TLR4结合MyD88的TIR结构域，同时MyD88的死亡结构域活化IRAK家族，IRAK1经IRAK4磷酸化后从MyD88上游离，转向肿瘤坏死因子受体因子(TRAF)-6进行结合，TRAF-6通过磷酸化IKK，激活NB-κB〔14，15〕。本研究结果提示NF-κB与DN病程关系紧密，这可能与持续的高糖环境刺激促使NF-κB活化因子生成增加，导致NF-κB表达增多有关。但也有学者〔11〕认为是高糖环境通过对去泛素化酶CYLDN表达的抑制激活了NF-κB，NF-κB激活后刺激下游细胞黏附分子、炎性因子、趋化因子等细胞因子表达，这些因子通过不同途径促进肾脏内皮细胞凋亡、加重炎细胞聚集、调控凝溶之间的平衡等，最终造成微血管病变，形成DN。