烟碱型乙酰胆碱受体亚单位a5基因多态性与吸烟老年人肺癌的关系

解宝泉 黄 艳 张志艳 王 袁 郭 霞 王红阳

(华北理工大学附属医院呼吸科，河北 唐山 063000)

流行病学研究显示肺癌以男性、吸烟病人居多，且发病年龄多在60岁以后，成为造成老年人死亡的第一位癌症杀手〔1〕。肺癌发生是环境和遗传因素协同作用的结果。研究显示人类第15号染色体长臂15q24-25区域上编码的烟碱型乙酰胆碱受体的候选基因簇即尼古丁受体家族(CHRNA3-CHRNA5-CHRNAB4，CHRNA3/5)与吸烟行为导致肺部疾病密切相关，但有关烟碱型乙酰胆碱受体基因位点突变与肺癌的关系目前尚有争议〔2，3〕。本研究采用病例对照研究方法，分析烟碱型乙酰胆碱受体亚单位a5(CHRNA5)-rs 17486278位点基因多态性与吸烟老年人肺癌的关联性，为肺癌病因的研究提供流行病学依据。

1 对象与方法

1.1对象 2011年1月至2016年1月华北理工大学附属医院确诊的216例男性、吸烟的老年原发性肺癌患者为研究对象，年龄60～80岁；按照年龄±2岁、同性别进行1∶3配对抽取健康体检人群648例，后期采集血标本基因测序过程中9例患者血液凝固未完成实验，被剔除，对照组样本有效率98.6%，符合实验要求，对照组最终入组人群639例，年龄61～79岁。病例组入选标准：①病理组织学确诊为原发性支气管肺癌，参照WHO肺癌组织学分型标准分为鳞癌、大细胞癌、小细胞癌、腺癌、腺鳞癌及其他；②单一肺癌，未合并其他肿瘤；③知情同意。对照组入选标准：①与病例无血缘关系；②无慢性非传染性疾病者；③知情同意。

1.2方法 由统一培训的调查员进行面访调查，现场回收问卷。

1.2.1一般资料 吸烟史(持续1年或1年以上者认定为吸烟)、饮酒(平均每周饮白酒1两及以上，或相当酒精含量的其他酒类，并连续饮1年以上者)、工作环境(是否接触有害物质如长期接触医源性X线、工作中煤尘、玻璃纤维、橡胶制品、塑料加工等)、是否合并慢性肺部疾病(如支气管炎、慢性阻塞性肺部疾病、肺结核及尘肺等)、家族肿瘤史等。

1.2.2CHRNA5基因多态性 采集5 ml清晨空腹静脉血标本，置-80℃低温冰箱贮存。按试剂盒说明书进行DNA抽提(血液基因组提取试剂盒：BiomigaSanDiego，CA)。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测各基因各位点的基因型。操作流程：配制质量分数为3%的琼脂糖凝胶，内含0.5 μg/ml的溴乙锭。取扩增产物5 μl加电泳载样液少量(6倍上样缓冲液)，120 V电压泳动30 min，于凝胶成像系统下观察，根据PCR产物泳动的距离，参照DNA标准分子量泳动的位置确定扩增效果。将已扩增出来的DNA产物用限制性酶进行酶切后，判断扩增产物的基因型。内切酶NIaⅢ0.4 μl，PCR扩增产物5 μl，10×NEB缓冲液1.2 μl，100×牛血清白蛋白(BSA)缓冲液0.12 μl，灭菌双蒸水5.28 μl，混合后，置37℃水浴消化3 h。15 ml Tris硼酸(TBE)缓冲液中加入6 g琼脂糖，电磁炉上加热溶解，溶解后冷至60℃，加入2 μl EB染料，倒入已插入梳子的制胶槽中，待其冷却凝固后待用。取5 μl酶切产物，加6倍上样缓冲液少量，混合后，琼脂糖凝胶电泳，电压100 V，电泳60 min，于凝胶成像系统下观察，根据条带数(与标准分子量对照)确定其基因型。

1.2.3应对方式 采用医学应对问卷(MCMQ)进行评测。该量表共20个条目3个维度：面对、回避和屈服。20个条目均按1～4四级计分，其中第1，4，9，10，12，13，18，19条等8个条目需反评计分。“面对”量表分由1，2，5，10，12，15，16，19 等条目分累计；“回避”量表分由3，7，8，9，11，14，17等条目分累计；“屈服”量表分由4，6，13，18，20等条目分累计。按各分量表的总分计分。通过对这3个分量的评分，计算各维度平均分值，平均分值/各维度满分，计算出患者相对得分，以评估3类应对策略，某分量表相对得分越高，表明个体越倾向于采用这种应对方式。由于样本量有限，将倾向于面对应对方式确定为积极应对，将回避、屈服应对方式确定为消极应对〔4〕。

1.2.4营养认知行为 根据最新公布的《中国居民膳食指南》，以胡倩倩等〔5〕研制营养(K-A-P)问卷为蓝本，修改其中有关孕妇的膳食理念为老年人膳食基本原则，修改孕妇营养素来源为老年人常见疾病，包括癌症与营养素等。对老年人营养知识、态度、行为调查。共30题，每题2 分共60分，≥40分判定营养认知行为良好，<40分为差〔5〕。

1.3统计学分析 用SPSS19.0统计软件处理，两组间样本均数的比较采用t检验，计数资料比较用χ2检验，各相关因素与肺癌的关系用条件Logistic回归模型行多因素统计分析。

2 结 果

2.1两组相关因素比较 两组年龄、文化程度、婚姻情况方面差异无统计学意义(P>0.05)；两组吸烟年限、每天吸烟量、是否饮酒、是否有肿瘤家族史、是否存在职业有毒物质暴露危险、是否合并肺部慢性疾病、应对方式及营养认知行为方面，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 两组人群相关因素比较(n)

1)为t检验，其他为χ2检验；2)合并肺结核、慢性阻塞性肺疾病、尘肺等

2.2两组CHRNA5-rs 17486278位点基因类型和基因频率比较 两组均可检测到CHRNA5-rs 17486278位点基因片段，且符合Hardy-Weinberg平衡检验(P>0.05)。CHRNA5-rs 17486278位点基因型包括野生型(AA)、杂合变异型(AC)、纯合变异型(CC)。经χ2检验，病例组和对照组间该多态性位点基因型、各等位基因分布频率之间比较差异有统计学意义(χ2=8.045，P=0.005；χ2=10.067，P=0.002)。见表2。

表2 两组CHRNA5-rs 17486278位点基因型和等位基因频率比较〔n(%)〕

2.3CHRNA5-rs 17486278位点基因多态性与原发性肺癌关联性的多因素回归分析 以是否发生肺癌为因变量y，以基因型(CC=1、AC=2、AA=0)、基因频率(C等位=1、A等位=0)、文化程度(≥9年=1、<9=0)、配偶情况(无=1、有=0)、吸烟年限(≥25年=1、<25=0)、每天吸烟量(≥10支=1、<10支=0)、饮酒(否=1、是=0)、合并肺部疾病(是=1、否=0)、肿瘤家族史(否=1、是=0)、职业有毒物质暴露(否=1、是=0)、应对方式(积极=1、消极=0)和营养认知行为(良好=1、一般=0)为自变量进行Logistic回归分析，结果显示吸烟年限、每天吸烟量、合并肺部疾病和营养认知行为是吸烟老年人肺癌发生的影响因素(P<0.05)；CA和CC基因型、C等位基因频率与原发性肺癌存在一定关联性。见表3。

表3 CHRNA5基因-rs 17486278多态性与原发性肺癌关联性的多因素Logistic回归分析

2.4吸烟和 CHRNA5-rs 17486278位点基因的交互作用对肺癌发生的影响 进一步应用条件Logistic回归分析，结果显示吸烟年限、每天吸烟量与CHRNA5-rs 17486278位点基因多态性之间联合作用对肺癌发生的影响差异无统计学意义(P>0.05) 。见表4。

表4 两组吸烟和CHRNA5-rs 17486278位点基因交互作用的Logistic回归分析

调整合并肺部慢性疾病、营养认知行为

3 讨 论

目前国内肺癌的发病率为每年增长26.9%，死亡率居癌症之首〔1〕。流行病学调查显示肺癌发病危险因素复杂，目前普遍认为吸烟是肺癌的主要危险因素，吸烟者发生肺癌的相对危险度为2.5～10.0〔6〕。本研究以吸烟老年人为研究对象，发现肺癌发生与吸烟年限和吸烟量密切相关，与目前国内外报道〔6〕相似。肺癌的发生有一定家族聚集性，有恶性肿瘤家族史者肺癌风险上升〔7〕；具有呼吸系统疾病史尤其是慢性呼吸道炎症可引起肺部免疫功能降低和局部气管黏膜增生和鳞状上皮化生等病变，使肺癌风险亦有一定程度地上升〔8〕。本研究未发现肿瘤家族史与肺癌风险的关联，可能与本组病例均为老年人，对家族疾病史认识或了解不清楚有关。本文发现良好的营养认知行为可使肺癌风险一定程度降低。合理的饮食行为可增加机体抗氧化能力、免疫能力，并有一定改善肺功能的作用，因而对肺癌的发生有一定的保护作用〔9〕。

流行病学研究显示编码烟碱型乙酰胆碱受体的CHRNA基因变异与肺癌发生相关，可能是肺癌发生的候选基因，例如Thorgeirsson等〔10〕在欧洲人群中发现CHRNA5基因簇上的rs 1051730、rs 8042374和rs 12914385多态性对肺癌的影响存在交互作用，但因研究的人群种族或样本量等原因，Amos等〔11〕和Wei等〔12〕研究未得出相似的结论。本研究发现CHRNA5-rs 17486278位点基因多态与吸烟老年人肺癌有关，且CHRNA5-rs 17486278位点基因的变异与吸烟的年限和吸烟的量有关，这和李琴等〔13〕的研究结果相似，该作者通过回顾性研究发现每天吸烟量>15支者肺癌发生的风险高于不吸烟者(OR=3.49，95%CI：2.29～5.32)，且吸烟与CHRNA5-rs 17486278位点基因的变异存在交互作用。研究已证实体外烟草中的主要成分尼古丁与肺癌细胞表面的烟碱型乙酰胆碱受体结合，可调节缺氧诱导因子(HIF)-1α、促进肺癌细胞增殖、迁移、侵袭及肿瘤血管新生，同时诱导凋亡抑制基因，抑制肺癌细胞凋亡〔14，15〕。但减少烟草摄入能否抑制该位点基因突变，减少疾病的发生率，有待进一步的研究。