血清p53自身抗体在乳腺癌中的诊断价值

杨时煌 罗育豪 翁雪芬 彭裕辉 许镒洧

(汕头市龙湖区第二人民医院急诊科，广东 汕头 51500)

近年来欧美国家乳腺癌的死亡率逐年下降，其中早期筛查和早期诊断发挥了重要作用〔1〕。早期发现乳腺癌，可显著提高患者生存率，并且增加患者保乳治疗率。寻找乳腺癌早期诊断血清/血浆分子标志物，无疑将有助于早期发现乳腺癌。近10年来的研究发现，针对肿瘤相关抗原的自身抗体标志物有望成为肿瘤早期诊断血清分子标志物〔2～4〕。本研究分析乳腺癌患者、乳腺良性肿瘤患者和正常对照者p53自身抗体的血清水平，探讨血清p53自身抗体与乳腺癌的相关性及诊断价值。

1 资料与方法

1.1临床资料 于2012年10月至2013年6月，在汕头大学医学院附属肿瘤医院乳腺中心收集乳腺癌患者125例和乳腺良性肿瘤患者33例。所有患者均为治疗前患者，并经过活组织病理学检查确诊。125例乳腺癌患者均为女性，年龄40～72岁，中位年龄51岁。33例乳腺良性肿瘤患者均为女性，年龄31～68岁，中位年龄46岁。正常对照组为116例年龄与乳腺癌患者匹配的女性体检者，并被证实无任何肿瘤相关疾患，年龄41～70岁，中位年龄50岁。所有标本均经医院伦理委员会的批准，患者均知情并同意。所有的受试者均在早晨空腹行静脉采血，采集3 ml，静置30 min后离心(3 500 r/min)10 min，分离得到的血清在低温冰箱-80℃保存。

1.2仪器和检测试剂 酶标仪(赛默飞公司品牌)，酶标板(96孔，江苏海门浩天生物器材厂)，人p53重组蛋白和兔抗p53多克隆抗体(舟山同生生物科技公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG或羊抗兔IgG(美国Santa Cruz公司)，3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB，厦门英科新创公司)。

1.3p53自身抗体的检测 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清中p53自身抗体。用磷酸盐缓冲液(PBS)将人p53重组蛋白稀释到0.1 μg/ml，包被于酶标板，4℃过夜。弃去酶标板孔内液体，采用自制含吐温-20的磷酸盐缓冲液(PBST)对酶标板洗板3次。酶标板各孔加入封闭液200 μl(1%牛血清白蛋白+PBST)，孵育1 h(37℃)，洗板。加入100 μl受试者血清样品(1∶110稀释)和质控样品(50例乳腺癌患者的血清混合制成)，封闭液作为阴性对照，兔抗p53多克隆抗体作为阳性对照，所有检测均做两平行孔，并与温箱孵育1 h(37℃)，洗板；加入辣根过氧化物酶(HRP)羊抗人IgG或羊抗兔IgG(均为1∶10 000稀释)，孵育1 h(37℃)，洗板5次；最后，每孔加入显色液100 μl(TMB-过氧化氢)，显色15 min(37℃避光)；加入终止液50 μl，酶标仪在测定波长为450 nm、校正波长为630 nm时检测各样品的A值(即A450 nm/A630 nm)。判断临界值(Cutoff值)：116例正常对照组血清p53自身抗体检测OD值的均数加上2倍标准差(sd)，阳性为≥临界值，阴性<临界值。

2 结 果

2.1血清p53自身抗体在乳腺癌、乳腺良性肿瘤患者和正常对照组中的水平 血清p53自身抗体的平均滴度水平在乳腺癌组、乳腺良性肿瘤组和正常对照组中分别为0.159±0.252、0.060±0.053和0.045±0.037。与正常对照组相比，血清p53自身抗体的平均滴度水平比乳腺癌组和乳腺良性肿瘤组均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05，图1)。进一步分析显示，在乳腺癌组，血清p53自身抗体的平均滴度水平比乳腺良性肿瘤组升高，差异也有统计学意义(P<0.05，图1)。

2.2p53自身抗体检测乳腺癌的诊断价值 ROC曲线分析显示(图2)，p53自身抗体区分乳腺癌和正常对照组的AUC值为0.715(95%置信区间：0.652～0.779)，区分乳腺癌和乳腺良性肿瘤患者的AUC值为0.625(95%置信区间：0.527～0.724)。根据Cutoff值的判断标准，p53自身抗体对乳腺癌的诊断Cutoff值为0.119。此时，检测p53自身抗体区分乳腺癌患者和正常对照组的敏感度为32.8%，特异度为95.7%；区分乳腺癌和乳腺良性肿瘤患者的敏感度为32.8%，特异度为87.9%。

图1 p53自身抗体在各组血清中的水平

图2 血清p53自身抗体区分乳腺癌和正常对照组(A)及乳腺癌和乳腺良性肿瘤(B)的ROC曲线图

3 讨 论

乳腺癌患者5 年生存率与肿瘤分期密切相关。张敏璐等〔4〕的研究表明，早期乳腺癌5年生存率为98.3%，中期乳腺癌为83.5%，伴远处转移者仅为23.3%。由此可见，早期发现乳腺癌对提高患者总体生存率意义重大。目前，临床上常用的乳腺癌相关肿瘤标志物，如癌胚抗原(CEA)、糖链抗原(CA)153等，在晚期乳腺癌具有较高的敏感性，但这些标志物的阳性率在早期乳腺癌中并不高。近年来研究证实，在不同类型的肿瘤患者，无论早期或晚期，对比正常人群，均可检测到血清针对肿瘤相关抗原的自身抗体水平提高〔5〕，提示自身抗体检测在恶性肿瘤血清学早期诊断方面的潜在应用前景。在乳腺癌方面，有研究表明自身抗体可以在乳腺癌发病前5年的无症状阶段被检测出阳性结果〔6〕。Dyachenko等〔7〕研究发现，与正常对照者相比，Zuotin相关因子(ZRF)自身抗体和R序列包含蛋白(KRR)1自身抗体在早期乳腺癌患者血清中的水平均显著升高。这些研究提示，肿瘤自身抗体在乳腺癌患者血清中是存在的，有潜力作为一种有效的乳腺癌早期诊断方法。

p53基因是一种抑癌基因，是细胞生长重要的负调节因子。p53的功能与肿瘤发生发展、细胞凋亡等关系密切。人类肿瘤中，p53突变是最常见的基因突变，50%以上的肿瘤会出现该基因突变。研究提示，肿瘤自身抗体的产生与肿瘤相关抗原的突变、过表达和翻译后修饰等密切相关〔8～10〕。血清p53自身抗体在绝大多数恶性肿瘤患者(如食管癌、肝癌、结直肠癌等)中水平升高〔11，12〕。在乳腺癌方面，Liu等〔13〕发现p53自身抗体在102例乳腺癌患者和146例正常对照者中的诊断敏感性为24.5%，特异度为90.0%；其中，在早期乳腺癌患者，其诊断敏感度为22.8%。Yang等〔14〕的研究证实，p53自身抗体对乳腺癌的诊断敏感度为31%，特异度为100%。本研究表明p53自身抗体不仅可以区分乳腺癌患者和正常对照者，而且有助于区分良恶性乳腺肿瘤。

综上所述，本研究提示p53自身抗体与乳腺癌患者存在相关性，具有一定的诊断价值。然而，p53自身抗体对乳腺癌的诊断敏感度较低，即使血清p53自身抗体检测能最终用于对乳腺癌患者的早期发现，也必须联合其他自身抗体等分子标志物，进一步提高诊断敏感度，并通过大样本、多中心研究进行验证。