红景天苷通过JAK2/STAT3通路抑制退变髓核细胞的炎症反应和凋亡

鲁花 于露 甄欢欢 刘汝银 岳宗进

河南中医药大学第二附属医院(河南省中医院)，河南 郑州 450002

腰椎间盘突出是腰腿痛最常见的原因之一，椎间盘退行性病变是基本致病因素，髓核细胞凋亡导致的细胞数量减少是椎间盘退变的主要形态学改变之一[1]，但目前引起其凋亡的机制尚未完全明确。JAK2/STAT3信号通路存在于大多数细胞内，其对细胞增殖、分化、转化及凋亡有着至关重要的作用[2, 3]，可被炎性应激激活，主要功能为介导应激反应中的细胞凋亡[4]。而退变椎间盘组织可以分泌众多炎性因子，如白介素(IL-1β 和IL-6)、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、一氧化氮和前列腺素E2等[5]。

红景天苷(salidroside)是我国传统中药红景天最重要的有效成分之一，具有多种药理活性，有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、肝保护、神经保护等作用[6, 7]。但是关于红景天苷在腰椎间盘突出方面的研究却鲜有报道。本研究通过氧糖剥夺培养正常人髓核细胞构建退变髓核细胞模型，观察红景天苷对退变髓核细胞的影响并探讨其可能的机制，为治疗椎间盘髓核细胞退变引起的腰椎间盘突出提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

人髓核细胞(human nucleus pulposus cells, HNPCs) 购自上海中乔新舟生物科技有限公司，进口于美国ScienCell研究实验室；红景天苷(纯度>98%)购自南京朗朗科技销售有限公司，10 mg 红景天苷溶于1 mL 无菌PBS 配制红景天苷工作液，即红景天苷工作液浓度为10μg/μL；JAK2/STAT3 特异性抑制剂(AG490) 购自北京启维益成科技有限公司；DMEM 细胞培养液购自美国HyClone 公司；胎牛血清和胰蛋白酶购自美国Gibco公司；β-actin、p-JAK2 和p-STAT3抗体及对应荧光二抗购自美国Invitrogen 公司；流式细胞术凋亡检测试剂盒购自美国BD Biosciences 公司；TNF-α、IL-1β 和IL-6 ELISA 试剂盒购自上海巧伊生物科技有限公司；总RNA 抽提试剂盒、M-MLV 逆转录酶和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自大连宝生物工程有限公司；引物合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 HNPCs细胞退变模型和分组

HNPCs 细胞复苏后，用10% 胎牛血清(FBS)的DMEM细胞培养液(pH7.2)，置于37 ℃含有5% CO2的培养箱中培养。 根据细胞生长情况，2～3 天换液1次，待生长到80%～90% 融合时用胰蛋白酶消化传代。将生长良好的髓核细胞制成细胞悬液，接种于25 mL培养瓶中(5 mL/瓶)，分为正常培养组和氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation，OGD) 培养组。OGD组细胞换无血清DMEM培养液，在1% O2/94% N2/5% CO2气体组分中培养，模拟体内椎间盘退变微环境。12 h后收集细胞进行相关实验。

实验分组：实验分为2部分：第一部分： Control 组：正常培养HNPCs，1 mL 培养液中加入5 μL 不含红景天苷的无菌PBS；OGD 组：氧糖剥夺培养HNPCs，1 mL 培养液中加入5 μL 不含红景天苷的无菌PBS；低浓度(10μg/mL)红景天苷组：氧糖剥夺培养HNPCs，1 mL 培养液中加入1 μL 红景天苷工作液；中浓度(30μg/mL)红景天苷组：氧糖剥夺培养HNPCs，1 mL 培养液中加入3 μL 红景天苷工作液；高浓度(50μg/mL)红景天苷组：氧糖剥夺培养HNPCs，1 mL 培养液中加入5 μL 红景天苷工作液。第二部分：Control 组；OGD 组；红景天苷组：采中浓度(30μg/mL)红景天苷作用于退变HNPCs；AG490 组：30 μmol /L AG490作用于退变HNPCs。红景天苷+ AG490 组：30μg/mL红景天苷+30 μmol /L AG490 共同作用于退变HNPCs。

1.3 Real-Time PCR (RT-PCR)

采用总RNA 抽提试剂盒提取各组细胞的总RNA，随后用M-MLV 逆转录酶合成cDNA。实时定量液12 μL，cDNA 模板2 μL，上下游引物各1 μL，灭菌蒸馏水4 μL。反应条件：94 ℃ 预热10 min；40 个循环 (95 ℃ 30 s；60 ℃ 35 s；72 ℃ 50 s); 72 ℃ 延伸10 min。采用2-ΔΔCt进行数据处理。 RT-PCR引物序列如下表：

表1 RT-PCR引物序列Table 1 The primer sequences of RT-PCR

1.4 Western blot

以 β-actin 作为内参蛋白，测定Aggrecan 和 Col2a1 的表达，以JAK2/STAT3为内参，测定JAK2、STAT3活化形式p-JAK2、p-STAT3的表达。RIPA裂解法处理细胞提取蛋白，考马斯亮蓝法测定总蛋白浓度。样品经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移至PVDF 膜。然后加入封闭液室温下摇床上孵育60 min，一抗分别采用1∶200稀释的小鼠抗人Aggrecan抗体、1∶500稀释的小鼠抗人Col2a1抗体、1∶1 000稀释的小鼠抗人p-JAK2 和p-STAT3的单克隆抗体，再分别用1∶1 000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG室温摆摇床上孵育60 min，ECL法显影，胶片拍照，计算蛋白的相对表达量。

1.5 ELISA

收集细胞培养液，离心后收取上清液，按1∶100 稀释后加入酶标反应孔中，在37 ℃条件下孵育1 h，随后用洗涤液洗涤3 遍，每次3 min。每孔加入100 μL 酶标抗体，再次在37 ℃条件下孵育1 h，每孔加入100 μLTMB-过氧化氢尿素溶液， 37 ℃下避光放置5 min，加入50 μL 终止液终止反应，测定各孔在波长450 nm 处的光密值[OD(450) ]，并根据标准曲线换算为浓度。

1.6 流式细胞凋亡法检测髓核细胞凋亡

各组细胞经过处理达到实验要求后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化后，经2 000 r /min，离心5 min。用PBS 重悬洗涤2 次，加入500 μL 缓冲液悬浮细胞。随后每管加入5 μL Annexin V-EGFP 和5 μL 碘化丙啶(PI) 混匀后避光反应15 min，用FACSCalibur cytometer 流式细胞仪进行检测。

1.7 统计学分析

实验数据用均数±标准方差表示，利用SPSS 18.0 统计软件进行数据分析，采用t检验和单因素方差分析(one-way ANOVA) 比较组间的差异，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 氧糖剥夺后HNPCs Aggrecan 和Col2a1 表达水平显著降低

正常髓核细胞可分泌蛋白聚糖(Aggrecan) 和Ⅱ型胶原(Col2a1) 合成细胞外基质，进而维持髓核的稳态。退变髓核细胞的变化表现为蛋白聚糖解聚增多，Ⅱ型胶原变性[8]。通过检测氧糖剥夺培养的HNPCs中Aggrecan 和Col2a1 表达的变化，验证体外退变髓核细胞模型的建立是否成功。HNPCs 经12 h 无血清无糖低氧处理后，采用RT-PCR检测细胞质中Aggrecan 和Col2a1 的mRNA表达水平，如图1 A所示；采用Western blot检测细胞质中Aggrecan 和Col2a1 蛋白表达水平，如图1B所示。与Control 组相比，OGD 组细胞质中Aggrecan和Col2a1 的mRNA表达水平显著降低，证明HNPCs 合成Aggrecan 和Col2a1 的能力被无血清无糖低氧处理显著抑制，HNPCs 退变模型建立成功。

2.2 红景天苷抑制髓核细胞退变造成的细胞凋亡

流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况。如图2结果显示：OGD组细胞凋亡率显著高于Control组，三种不同浓度的红景天苷作用于氧糖剥夺培养的髓核细胞，与OGD组相比较，三组红景天苷组细胞凋亡率均有所下降，其中30μg/μL红景天苷组细胞凋亡率最少，证明30μg/μL红景天苷组抵抗OGD造成的细胞凋亡效果最好，选择30μg/μL浓度红景天苷进行后续实验。

图1 细胞质中Aggrecan 和Col2a1的表达水平下降 与Control组相比，*P<0.05Fig.1 The expression of Aggrecan and Col2a1 decreased in cytoplasm. Compared with control group,*P<0.05

图2 流式细胞术检测人髓核细胞凋亡情况 与Control组相比，*P<0.05；与OGD组相比，#P<0.05Fig.2 Apoptosis rate of nucleus pulposus cells was assayed with flow cytometry. Compared with control group,*P<0.05; Compared with OGD group,# P<0.05

2.3 红景天苷抑制髓核细胞炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达

ELISA结果显示，与Control组相比较，OGD组TNF-α、IL-1β和IL-6的表达显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与OGD组相比较，红景天苷组TNF-α、IL-1β和IL-6的表达降低(P<0.05)，图3。说明红景天苷能够抑制退变髓核细胞的炎症反应。

图3 ELISA检测TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平 红景天苷：30 μg/mL；*P<0.05，与Control组比较；#：P<0.05，与OGD组比较，差异具有统计学意义Fig.3 Levels of TNF-α, IL-1β, and IL-6 were measured with ELISA. Salidroside: 30 μg/mL; Compared with control group,* P <0.05; Compared with OGD group,# P <0.05.

2.4 红景天苷抑制JAK2/STAT3信号通路

为了探索红景天苷调控髓核细胞凋亡和炎症反应的机制，通过Western blotting 分析JAK2/STAT3信号通路的活化情况。 用30μg/mL 红景天苷刺激髓核细胞，观察发现JAK2和STAT3磷酸化水平降低。使用JAK2/STAT3 信号通路抑制剂AG490 30 μmol/L，当信号通路抑制剂与红景天苷共同作用于退变髓核细胞时，JAK2和STAT3磷酸化水平更低，图4。

2.5 AG490对髓核细胞凋亡及炎症反应的影响

为了进一步分析红景天苷参与退变髓核细胞凋亡和炎症反应的信号通路，红景天苷或红景天苷与信号通路抑制剂AG490共同作用于退变髓核细胞。流式细胞术检测髓核细胞的凋亡，与红景天苷组相比，AG490组降低细胞凋亡的效果更显著(图5 A，P<0.05)。ELISA检测细胞炎症因子分泌情况，与红景天苷组相比，AG490组TNF-α、IL-1β和IL-6的表达更低(图5B，P<0.05)。

图4 红景天苷对退变髓核细胞JAK2/STAT3信号通路的影响*：P<0.05，与Control组比较，#：P<0.05，与OGD组比较；&： P<0.05，与红景天苷组比较，差异具有统计学意义Fig.4 The effect of salidroside on JAK2/STAT3 signal pathway. Compared with control group,* P<0.05; Compared with OGD group,# P <0.05; Compared with salidroside group,& P <0.05

3 讨论

髓核占椎间盘50%～60%的横断面积，主要由Aggrecan、水和Col2al 构成，具有良好的弹性和膨胀性[9]。退变髓核细胞中，Aggrecan浓度降低、Ⅰ型胶原取代Col2al，椎间盘开始塌陷，纤维环和周围韧带撕裂[10]，加速了椎间盘的退变。本实验通过氧糖剥夺模拟退变髓核细胞在人体内所处的微环境，结果显示，氧糖剥夺培养组Aggrecan 和Col2a1 的表达显著减少，说明我们成功的构建了体外培养的退变髓核细胞模型。

髓核细胞凋亡导致的细胞减少是椎间盘退变的主要形态学改变之一[11]。炎症因子的分泌是诱发髓核细胞凋亡的重要因素[12]。退变椎间盘中的髓核细胞可以分泌TNF-α、IL-1β和IL-6 等多种炎症因子[13, 14]。TNF-α 则是人体主要促炎因子，对中性粒细胞和单核细胞有趋化作用，并使之活化和脱颗粒，释放炎性介质，诱导髓核细胞凋亡，同时还可抑制髓核细胞外基质表达，从而参与椎间盘退变的病理过程[13]，在椎问盘退变过程中，IL-1β扮演了极为重要的角色[15]。IL-1β-能刺激髓核细胞产生其他细胞因子，如IL-6、前列腺素E2等[16]，上调基质降解酶的表达和活性，加速细胞外基质的降解[16, 17]。除此之外，IL-1β还能抑制蛋白多糖和Ⅱ型胶原的合成，加重椎间盘退变[18]。IL-6 在生物力学不稳的脊柱节段的椎间盘及退变椎间盘中的含量明显高于正常[19, 20]，被认为是椎间盘退变的关键因子之一[21]。

图5 JAK2/STAT3信号通路抑制剂AG490抑制退变髓核细胞的凋亡及其炎症因子的分泌 *：P<0.05，与OGD组比较；#：P<0.05，与红景天苷组比较，差异具有统计学意义Fig.5 The inhibitor of JAK2/STAT3 signal pathway AG490 inhibits apoptosis and inflammatory cytokine secretion in degenerated nucleus pulposus cells Compared with OGD group,* P<0.05; Compared with salidroside group,# P<0.05

JAK2/STAT3信号通路是多种细胞因子信号转导的共同通路之一，可转导多种细胞因子细胞内的信号，将细胞膜感受到的信号直接传递至核内，启动基因转录[22]。JAK2和STAT3作为该家族中的重要成员，在信号转导过程中发挥着重要作用[23]。研究表明，多种细胞因子可诱导JAK2活化，进而激活下游STAT3表达，最终导致细胞行为和功能的改变[24]。目前已发现多种细胞因子，包括TNF-α、IL-1β和IL-6 等，它们通过激活JAK/STAT信号转导通路，在炎症反应的发生、发展过程中发挥作用[25]。同时，已有研究发现JAK2/STAT3信号通路调控退变椎间盘髓核细胞相关基因的分解代谢[26]。因此，髓核细胞的退变与JAK2/STAT3信号通路密切相关。红景天苷是中药红景天的主要活性成分，具有较好的抗炎、抗氧化作用[27]。目前尚未报道红景天苷在椎间盘突出中对JAK2/STAT3信号通路的影响。

本研究结果发现，与对照组相比，退变髓核细胞模型中髓核细胞的凋亡率增加，TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度显著增加，与OGD组相比，红景天苷能够显著降低退变髓核细胞的凋亡和炎症因子分泌。本研究进一步实验检测发现，退变髓核细胞中p-JAK2和p-STAT3蛋白水平增加。考虑可能在髓核细胞退变过程中，炎症因子的过度表达导致JAK2和STAT3的活化，使其与相应位点结合，进而诱导了JAK2/STAT3通路进一步活化，促进炎症的发生以及椎间盘损伤。退变髓核细胞模型给予红景天苷或者AG490处理后， p-JAK2和p-STAT3的蛋白水平也显著受到抑制。AG490是JAK2选择性抑制剂，可通过阻断JAK特异位点上的酪氨酸或丝氨酸磷酸化而阻断下游激酶STAT的活化。

在本实验中红景天苷显著降低退变髓核细胞模型中TNF-α、IL-1β和IL-6的含量，具有改善退变髓核细胞炎症反应的作用，同时抑制JAK2/STAT3蛋白的磷酸化，这同AG490对退变髓核细胞凋亡和炎症反应的作用相一致。因此，我们推断红景天苷可能通过调控JAK2/STAT3信号通路减轻髓核细胞退变导致的椎间盘突出症。本研究阐述了红景天苷对退变髓核细胞损伤的作用机理，同时为临床椎间盘突出症的治疗提供理论支持。