染料木黄酮通过促进VEGF 表达改善去势大鼠骨质疏松的作用机制

蔡吓明 魏建铭

福建莆田学院临床医学院，福建 莆田 351100

骨质疏松症是骨组织微观结构破坏导致骨脆性增加的全身性骨骼疾病。美国约有 800 多万绝经后妇女患有骨质疏松[1]，雌激素替代疗法是预防骨质疏松的方案之一，Gen是天然的黄酮类物质，由于其分子结构含有3个羟基而具有一定的抗氧化能力[2-3]。具有广泛的生物学效应，如抗肿瘤，防治骨质疏松，改善更年期症状，治疗心血管疾病等多方面效应[4-5]。本研究拟从血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) 调控角度，探讨染料木黄酮对骨质疏松的改善作用及其作用机理。

1 材料和方法

1.1 模型的建立

选用清洁级6月龄 SD雌性大鼠 40 只，体重200～220 g，由福州吴氏动物中心提供。去势组切除大鼠两侧卵巢后冲洗缝合伤口，假手术组手术过程不切除卵巢而切除小块脂肪组织。Gen(Sigma)30 mg /(kg·d)，1次/d。去卵巢术后第3天，对治疗组大鼠进行Gen溶液灌胃处理。去卵巢组和假手术组每日分别以生理盐水(6 ml/kg)灌胃。随机分为对照组，假手术组、去势组、Gen干预6周组、Gen干预12周组。

1.2 骨密度值检测

采用双能X线骨密度检测仪(美国Lunar公司)，测定大鼠左后肢股骨和胫骨的骨密度，用自带的软件进行数据分析。

1.3 血清中VEGF测定

在处死大鼠前，采集腹主动脉血液，离心后收集100 μl血清。采用ELISA试剂盒对血清中的VEGF表达进行检测，通过试剂盒提供的标准品进行梯度稀释获得标准曲线；在微量滴定板上加样，在450 nm波长光读取数值；VEGF浓度通过标准曲线来推算。用微量培养板分光光度计(Biotek)测定各样品在540 nm处的吸光度，检测VEGF表达变化。

1.4 骨组织计量学指标比较

麻醉取股骨，入4%多聚甲醛固定，逐级脱水脱脂后，再以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脱钙，制成蜡块，连续切片(厚度4 μm)。苏木精-伊红(HE)染色，光镜(日本Olympus BX51T-PHD-J11)观察骨细胞与细胞外基质分布。随机选取，高倍镜不同视野各测定一次，空缺骨陷窝数所占视野骨陷窝数的百分数。

1.5 VEGF原位杂交表达

按照VEGFmRNA原位杂交试剂盒(博士德)具体步骤操作进行染色、观察，图像分析。探针序列(博海生物)为，5′GCTCT ACCTC CACCA TGCCA AGTGG TCCCA3′；5′GACCC TGGTG GACAT CTTCC AGGAG TACCC3′；5′GCAGC TTGAG TTAAA CGAAC GTACT TGCAG3′。原位杂交过程用预杂交液替代探针工作液作阴性对照。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 血清中VEGF测定

与对照组相比，假手术组没有出现明显改变。去势组和干预6周组大鼠血清中VEGF表达明显下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。干预12 周组血清VEGF表达量没有明显差异(P<0.01)(图1)。

图1 各组血清中VEGF，P<0.01Fig.1 Serum VEGF of every group, P<0.01

2.2 骨密度值比较

与对照组相比，假手术组没有出现明显改变。去势组和干预6周组骨密度值明显下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。干预12周组与对照组骨密度值相比，没有明显差异 (图2)。

图2 各组骨密度值，P<0.01Fig.2 The bone mineral density of every group, P<0.01

2.3 各组骨组织形态学比较

对照组股骨的骨小梁较多较厚(图5A1)。假手术6周组骨小梁粗大稍厚，未见吸收或断裂现象 (图5A2)。去势6周组骨小梁排列稀疏变薄，骨髓腔变大，可见空缺骨陷窝(图5A3)。Gen干预6周组骨小梁尚未见大片成块状缺失，较多空缺骨陷窝(图5A4)。Gen干预12周组股骨的骨小梁较多较厚，未见骨小梁断裂，可见少量空缺骨陷窝(图5A5)。

2.4 组织计量学指标测定统计学结果

图5A 各组骨松质光镜下结构特点，HE法，标尺示40 μmFig.5A Structure characteristics of the trabecular bone under light microscope (HE staining, bar=40 μm).图5B 各组骨松质VEGF mRNA 表达的灰度值，原位杂交法，标尺示40 μmFig.5B Expression of VEGF mRNA in the trabecular bone using FISH method (bar=40 μm).

与对照组相比：假手术组空缺骨陷窝数没有出现明显改变，去势组和干预6周组空缺骨陷窝数均高于正常对照组，差别有统计学意义(P<0.01)。干预12周组松质骨空缺骨陷窝数与对照组比较差别无统计学意义 (图3)。

图3 各组空缺骨陷窝数，P<0.01Fig.3 The empty bone lacuree of every group, P<0.01

图4 各组VEGF mRNA表达灰度值，P<0.01Fig.4 Grayscale of VEGF mRNA of every group, P<0.01

2.5 VEGF mRNA 表达

VEGFmRNA 在对照组和假手术组股骨头骨髓腔血管内皮细胞都呈阳性反应(图5B1，B2)。去势6周组VEGF mRNA 阳性反应定位于骨髓腔血管内皮细胞胞质内，胞质呈棕褐色，胞核未显色(图5B3)。Gen干预6周组大鼠股骨头骨髓腔内皮细胞的表达稍增强，胞质呈棕黄色 (图5B4)。Gen干预12周组大鼠股骨头骨髓腔内皮细胞的胞质呈棕黄色，内皮细胞阳性反应细胞数增多 (图5B5)。

2.6 VEGF mRNA 表达灰度值结果分析

与正常组比较，假手术组股骨头VEGF mRNA 表达的灰度值无明显差异。去势组和干预6周组股骨头VEGF mRNA 表达的灰度值有显著性差异(P<0.01)。干预12周组大鼠 VEGF mRNA 的表达无明显差异 (图4)。

3 讨论

雌激素受体是成骨细胞和破骨细胞主要受体，通过与雌激素的结合可以增加成骨细胞的活性，增强成骨过程。相关动物实验证明去势后雌激素水平下降，促成骨作用下降，而破骨作用保持不变，造成骨盐代谢处于负平衡状态，出现骨密度降低，骨代谢生化指标异常等骨质疏松的病理变化[6]。临床表现为骨吸收大于骨形成，易发生骨折[8]，与本实验相关的骨密度测定在评测骨折风险方面的特异性较高，骨密度下降可以引起骨小梁结构的破坏，导致骨强度的下降，从而形成骨质疏松。

研究显示绝经后骨质疏松的发生可能与骨微血管的减少有关，骨质疏松是一个多因素，多阶段的氧化应激过程，可直接或间接地对细胞产生各种毒性作用，甚至引起细胞凋亡或坏死导致内皮细胞损伤。导致股骨近端由于不同解剖位置出现微循环障碍而导致大面积的非灌注区形成，股骨头组织广泛缺血缺氧，引起生长阻滞和骨质疏松。局部血管生成对骨质疏松的发病和转归有着重要的影响。有研究发现去卵巢的骨质疏松小鼠骨内部血管分布明显少于对照组，说明骨局部血管形成和骨质疏松有明显的关联[9]，血管生成在维持骨再生-骨吸收动态平衡过程中有重要作用。

本实验的VEGFmRNA作为一种自分泌因子表达贯穿骨组织发育演变过程的始终。VEGF是目前发现的功能最强大促进新生血管形成的细胞因子，主要通过旁分泌途径刺激血管内皮细胞有丝分裂和增加血管内皮细胞渗透性，在软骨—骨系统中参与共同调控骨组织的分化、基质生成和细胞因子的表达，能够很好反映成骨状态。

实验显示Gen对成骨细胞和破骨细胞有直接作用，Gen可直接作用于这些细胞，并通过调节这些细胞分泌局部因子而影响骨代谢。Gen增加破骨细胞凋亡，抑制骨吸收，降低骨转换，而增加骨密度[10]。已经有大量研究表明Gen对心血管疾病具有良好的防护作用，其主要通过以下途径[11]，Gen通过氢原子及超氧化物酶系的活力发挥抗氧化的作用；Gen通过诱导金属硫蛋白和影响其他氧化还原酶的表达，调节血脂作用，保护血管内皮细胞作用，抑制血管平滑肌细胞增生和血栓的形成。直接舒张血管作用等方面[12]。研究证实染料木黄酮可以对多种属的细胞，如大鼠，兔等的血管内皮细胞具有明显的抗氧化应激损伤作用。本结果显示Gen可以增强大鼠成骨细胞血管VEGF的表达。可以通过促进血管形成，从而具有抗骨质疏松作用。Gen防治骨质疏松的作用显著，但其量效关系及机制还需进一步研究。