MicroRNAs对骨质疏松症发病机制的研究进展

王爱飞 王亮 徐又佳

苏州大学附属第二医院骨科 苏州大学骨质疏松症诊疗技术研究所，江苏 苏州 215000

骨质疏松症是老年人常见的代谢性骨病，以骨量减少、骨密度下降和脆性骨折风险增高为特征，目前已成为全球性的公共健康问题。骨的代谢是骨吸收和骨形成不断转换的动态平衡，成骨细胞和破骨细胞的分化和功能活性在骨形成和骨吸收中有着关键作用。骨形成的主要是成骨细胞，成骨细胞是由间充质干细胞分化而来，其分化受多种激素、细胞因子的调控，如BMP2,4,7、TGF-β1/2、IGF1、VEGF、FGF2等[1]。骨吸收主要由破骨细胞进行，破骨细胞是唯一进行骨吸收的细胞。破骨细胞是一种TRAP(tartrate-resistant acid phosphatase)染色阳性，由多个前体破骨细胞聚集融合而成的多核巨细胞。成熟有功能的破骨细胞表面会有一种肌动蛋白环，其与破骨细胞的功能密切相关。破骨细胞由骨髓造血干细胞分化而来，其前体细胞为单核巨噬细胞，其分化受RANKL、M-SCF等细胞因子调控[2]。

1 MicroRNA的概述

Lee RC等在1993年发现了miRNA[3]，对RNA家族有了进一步的认识。miRNA是一种单链的、非编码的小RNA，其长度约20-22个核苷酸[4]。成熟的miRNA一般有两个来源：原始RNA(pri-miRNA)和前体RNA(pre-miRNA)。两者在核糖核酸酶Ⅲ(Drosha酶和Dicer酶)的作用下逐步形成成熟的miRNA[5]。原始RNA(pri-miRNA)由RNA聚合酶II转录而成的长度约1000核苷酸，含茎环结构的多聚苷酸转录物。核糖核酸酶Ⅲ(Drosha酶)和其辅因子DGCR8形成一种蛋白复合物(microprocessor)，它能够将pri-miRNA修饰成长度约65核苷酸，发夹结构的前体RNA(pre-miRNA)[6]。细胞核转运因子(Exp5)可以将pre-miRNA从细胞核转运到细胞质中，在细胞质中Dicer酶将pre-miRNA修饰成长度约22核苷酸，成熟miRNA双链结构。miRNA双链结构中的一条链会成为成熟的miRNA形成RNA诱导沉默复合物(RISC),同时另一条链被降解[7]。

miRNA通过和靶基因mRNA上的3’端非编码区域(3’UTR)结合，降解或抑制靶基因的mRNA，从而降低其翻译效率，在基因转录后水平发挥负性调控作用。一般来讲，每个miRNA都能作用于多个目标mRNA，大约1/3的蛋白基因序列都受到miRNA调控。因此，miRNA在基因调控中起重要作用，其在细胞的分化、增殖、凋亡、代谢的调控及其他许多生理过程中都具有重要作用[8]。近年来，研究发现多种miRNA在骨代谢异常和骨质疏松症的发生、发展中起着重要的调控作用。文献报道：miR-34c在小鼠体内的过表达可诱发年龄相关的骨量下降，miR-218可通过抑制破骨细胞的形成从而缓解骨质疏松症的发展[9]。

miRNA不仅在细胞内、组织内可以检测到，且在人的体液中，如血液、尿液、唾液及脑脊液中都可检测到[10]。miRNA一般会以两种形式被释放到细胞外液中，一种是以包含于胞囊内的形式释放到细胞外液中，包含miRNA的胞囊有两种，分别是外泌体和微小囊泡；另一种是以与其相关蛋白结合成复合物的形式释放到细胞外液。外泌体是由细胞内体发育为多囊小体，再由多囊小体形成直径约40-100 nm的小胞囊，它能够承载多种RNA，miRNA也包括在其中。外泌体与miRNA的转运的关系十分密切，其表面分子能够决定它被相应器官摄入的特异性[11]。因此，将miRNA作为相应疾病诊断的生物标志物和治疗的靶点是有意义的。

2 MicroRNA与成骨细胞

成骨细胞是最重要的骨形成细胞，在骨代谢中，成骨细胞是骨形成的主要承担者，它的增殖、分化以及功能活性直接影响着骨形成。因此，骨质疏松症和成骨细胞的关系十分密切。文献报道MicroRNAs在成骨细胞的增殖、分化过程中起着不同的作用，直接或间接地调控着成骨细胞的增殖、分化(表1)。

2016年《Natural Communication》报道miR-214-3p能够抑制骨形成。由破骨细胞分泌的miR-214-3p，经外泌体转运到成骨细胞，与ATF4(影响成骨细胞功能的一个重要转录因子)mRNA的3’非编码基因结合，抑制骨形成。通过抑制破骨细胞分泌miR-214-3p，能有效地促进骨形成[4]。另有研究表明：miR-214能够直接作用于FGFR1，降低FGFR1的表达水平，影响FGFR/FGFR1信号通路下游的Runx2和ERK1/2的磷酸化，抑制间充质干细胞向成骨细胞的分化[12]。

转录因子Runx2是影响成骨细胞分化和功能活性的一个重要因素，它受到BMP、TGF-β、Wnt等信号通路的调控。Smad7能够通过Smurf2介导的Runx2的降解抑制成骨细胞分化。miR-590-5p可以直接与Smad7的mRNA的3’非编码区域结合，使其翻译受到抑制，从而减轻Smad7对Runx2的抑制作用，间接地促进了成骨细胞的分化[8]。

Wnt/β-catenin信号通路在成骨细胞的增殖、分化以及骨组织的再生中起着重要作用，该通路的激活可以促进骨组织的再生。miR-10 a可作用于β-catenin的mRNA，降低β-catenin的蛋白表达水平，阻遏Wnt/β-catenin信号通路，抑制成骨细胞的分化[13]。

在许多骨质疏松症的患者中，间充质干细胞会由向成骨细胞分化转变为向脂肪细胞分化，而miR-27 a在这个转变过程中起着十分关键的作用。miR-27 a可以直接与Mef2的mRNA的3’非编码区域结合，降低Mef2的表达水平，使间充质干细胞更多地向成骨细胞分化，从而使骨相关指标上升[14]。然而，也有研究阐述了SATB2作为一个能够和Runx2相互作用促进成骨分化的因子，其mRNA能够被miR-27 a降解，使成骨细胞的分化受到抑制[15]。

miR-33家族中的miR-33-5p，是一种对机械力敏感的miRNA，可以促进成骨细胞的分化。高迁移率族蛋白(high mobility group AT-hook 2，Hmga2)在胚胎发育、细胞分化、细胞周期的变化、细胞凋亡、DNA的修复等多种细胞病理生理过程中起着重要作用，也能够负性调节成骨细胞的分化。miR-33-5p可以作用于Hmga2的3’非编码区域，降低Hmga2的蛋白表达水平，削弱Hmga2对成骨细胞分化的抑制作用，从而促进成骨细胞的分化[16]。

Zebing Hu等发现在失重所致的骨量丢失中，成骨细胞中的miR-132-3p水平明显上升。EP300是一种组蛋白乙酰基转移酶，能够将乙酰基与目的蛋白上的残余赖氨酸结合，从而保护它们不发生泛素介导的蛋白水解。EP300对Runx2的活性和稳定性的维持十分重要。miR-132-3p能够直接作用于EP300，降低EP300的表达水平，使得Runx2的稳定性和乙酰化水平大大下降，从而抑制成骨细胞的分化和功能活性[17]。

TNF-α是具有调节骨量变化功能的一种炎症因子，不仅可以提升破骨细胞的分化及功能活性，还能够抑制成骨细胞的分化。TNF-α/NF-kB信号通路能够直接提高miR-150-3p的表达水平，其中TNF-α能够直接刺激miR-150-3p的表达，NF-kB通过作用于miR-150的增强子，刺激miR-150-3p的表达。miR-150-3p能够直接和β-catenin的mRNA的3’非编码区域结合，降低β-catenin的表达水平，抑制成骨细胞的分化[18]。

H Li等研究发现，miR-216 a在人脂肪源性间充质干细胞(hAMSC)向成骨细胞分化过程中的表达水平明显上升，且可减轻地塞米松对成骨细胞分化的抑制作用。c-Cbl是一个编码泛素连接酶(RING finger E3)的基因，E3连接酶在许多信号通路中都有着重要的作用，影响着多种细胞的功能活性，其中磷酸肌醇3-激酶(IP3K)和丝氨酸蛋白激酶(ATK)相关的IP3K/ATK信号通路就受其负性调控。miR-216 a通过在转录后水平下调c-Cbl的表达水平，减轻c-Cbl对IP3K/ATK信号通路的拮抗作用，促进成骨细胞的分化[19]。

同源盒基因HOXA10，是一种骨形成蛋白BMP2可诱导的基因，能够激活骨形成转录因子Runx2及调节成骨细胞的基因表达，从而促进骨形成。在人骨髓间充质干细胞中，miR-320 a直接作用于HOXA10的mRNA，降低HOXA10的蛋白表达，从而抑制了人间充质干细胞向成骨细胞的分化[20]。

在成骨相关信号通路Wnt信号通路中，Wnt信号通路的众多抑制因子中，DDK2和SFRP2是miR-218的直接作用靶标，miR-218过表达能够同时抑制DDK2和SFRP2在基因水平和蛋白水平的表达[21]。因此，miR-218能够通过DDK2和SFRP2增强Wnt信号通路的活性；与此同时，Wnt信号通路活性的增强也可以引起miR-218的表达，形成正反馈调节[22]。

骨发育的过程中，miR-335-5p在成骨细胞中的表达水平会明显上升。miR-335-5p能够特异性地和DDK1的3’非编码区域结合，降低DDK1的表达。DDK1作为Wnt信号通路的抑制因子，在被抑制后，Wnt信号通路活性明显增强，成骨细胞的分化和功能活性也得到增强[23]。

表1 MicroRNA参与成骨细胞分化和功能Table 1 MicroRNAs involved in osteoblast differentiation and function

P，Positive regulator of osteoblastogenesis；N，Negative regulator of osteoblastogenesis.

3 MicroRNA与破骨细胞

破骨细胞是进行骨吸收的主要细胞，功能过度增强，会使骨平衡向骨吸收方向偏移，造成骨量减低。因此，破骨细胞的分化和功能活性直接影响骨量的变化。文献报道，多种miRNA参与了破骨细胞分化和功能的调控，其表达水平与骨质疏松症的发生、发展密切相关(表2)。

自噬是指无效的细胞元件被程序性降解的过程。自噬相关蛋白(ATG)在自噬泡形成中起关键作用，它的缺失会毁损破骨细胞的胞壁元件，减少骨吸收。研究发现miR-20 a能够特异性的与Atg16l1的3’非编码区域结合，降低其表达，抑制破骨细胞的分化和功能活性。低氧介导的破骨细胞分化，可通过上调的HIF-1α因子抑制miR-20 a的表达，减弱miR-20 a对Atg16l1的抑制，使破骨细胞分化和功能增强[24]。

Jing Y等发现在OVX小鼠骨质疏松模型中，小鼠的骨吸收增强和骨量丢失能够被miR-34 a相关处理明显改善。Tgif2能够经RANKL相关转录因子的正反馈调节通路，刺激自身及RANKL相关因子的表达，从而促进破骨细胞的形成。miR-34 a能够与Tgif2的mRNA的3’非编码区域结合，削弱其对破骨细胞分化的促进作用，抑制破骨细胞的分化[25]。

RANK-RANKL信号通路在骨质疏松症发生过程种发挥重要的作用，细胞因子RANK和其受体RANKL在前体破骨细胞表面结合，促进成熟多核巨细胞向破骨细胞分化，进而促进骨吸收。miR-106b能够和RANKL的3’非编码区域结合，降低其表达，抑制前体破骨细胞聚合，使破骨细胞分化降低[26]。

在佐剂性关节炎的小鼠模型中，用Pre-miR-124治疗，可使破骨细胞的数量明显减少。NFATc1是破骨细胞分化的一个关键因素，miR-124能够直接作用于NFATc1，抑制破骨细胞的分化，缓解关节炎的发展[27]。

肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF6)在破骨细胞的分化和多核破骨细胞的形成及成熟过程中起关键作用。在破骨细胞分化的过程中，miR-125 a的表达水平明显下降，是破骨细胞分化的负性调节因子。miR-125 a可直接作用于TRAF6因子mRNA 的3’非编码区域，抑制破骨细胞的分化和成熟[28]。

蛋白激酶(PKCα)是一种调控细胞分化和凋亡的丝/苏氨酸激酶，其对RANKL介导的破骨细胞分化及成熟有着关键作用。在RANKL相关的破骨分化和成熟过程中，miR-142-3p能够在mRNA和蛋白水平同时降低PKCα的表达，减少前体破骨细胞之间的连接和融合，抑制破骨细胞的功能[29]。

骨髓间充质干细胞(BMMSCs)可诱导破骨细胞的凋亡，雌激素能够使Fasl蛋白在BMMSCs中积聚来促进破骨细胞的凋亡。miR-181 a能够和Fasl基因mRNA的3’非编码区域结合，降低Fasl蛋白的表达。雌激素就是通过对miR-181 a的抑制，提高Fasl的表达，促进BMMSCs诱导的破骨细胞凋亡[30]。

研究发现RANKL介导的破骨细胞形成过程中，RANKL可抑制血红素加氧酶(HO-1)的表达，而上调的HO-1能抑制破骨细胞的分化。HO-1的表达能够被miR-183拮抗，miR-183可与HO-1mRNA的3’非编码区域结合，降低其翻译效率，减弱HO-1对破骨细胞分化的抑制作用，从而促进破骨细胞的分化[31]。

miR-214的过量表达，会导致骨密度降低和骨量减少。研究发现，miR-214不仅会抑制成骨细胞的分化和功能，且可促进破骨细胞的分化。在M-SCF和RANKL诱导的破骨细胞形成中，miR-214的水平明显上升。miR-214通过直接与Pten的3’非编码区域结合，激活PIK3/Akt/NFATc1信号通路，促进破骨细胞的分化[32]。

miR-218的表达在破骨细胞分化过程中会明显降低，过量表达的miR-218能够负向调节破骨细胞的形成。miR-218可作用于p38MAPK信号分子，抑制p38MAPK-c-Fos-NFATc1信号通路，阻止前体破骨细胞融合成有功能的成熟破骨细胞，并且抑制破骨细胞表面的肌动蛋白环的形成，从而抑制破骨细胞的成熟和功能[9]。

表2 MicroRNA参与破骨细胞分化和功能Table 2 MicroRNAs involved in osteoclast differentiation and function

P，Positive regulator of osteoclastogenesis；N，Negative regulator of osteoclastogenesis.

4 MicroRNA的临床应用

MiRNA受到广泛了的关注，尤其是在临床应用方面，因其容易在血清中得以检测，方便快捷，可作为相关疾病治疗的靶点或某些疾病的诊断的生物学标记。研究报道：2015年miR-34激动剂类药物能有效且安全地作用于原发性肝癌和转移性肝癌患者白细胞中的目标基因[33]。

miR-21在肝纤维化疾病模型(CDAA)小鼠肝脏中的水平比对照组CSAA要明显升高，在第3天到第24周都有明显上升，在第4周达到最高峰。miR-21在血清中的水平与在肝脏中水平是一致的，其上升是在第1周到第24周，最高峰也是在第4周.因此，血清中的miR-21水平，能够反映肝脏的纤维化，可作为肝纤维化疾病的血清指标[34]。

血清甲胎蛋白AFP作为肝细胞癌的诊断指标已是公认的，但约有1/3的早期患者的AFP血清水平不会发生明显变化，且特异性并不高，肝炎和肝硬化患者的AFP血清水平都会发生改变。研究发现肝细胞癌患者血清中的miR-27b-3p和miR-192-5p水平会明显上升，且其敏感性和特异性较AFP好，可作为肝细胞癌的诊断指标，尤其是对AFP阴性的肝细胞癌患者[35]。

临床研究表明，miR-10 a-5p的水平在急性髓细胞白血病(AML)患者血清中明显上升，其水平在血清中的敏感性和特异性都高达80%。且miR-10 a-5p的水平在AML发展地不同过程中是变化的，一定程度上影响着的AML患者病情的发展。MiR-10 a-5p血清水平较高的AML患者，预后较miR-10 a-5p水平不高者差，miR-10 a-5p有重要的临床应用价值[36]。

miR-216 a是一种胰腺特异性的miRNA，其在血清中的水平可以作为急性胰腺损伤的生物学标志[37]；miR-200 a，200b，200c可以用于卵巢肿瘤良恶性的诊断[38]，其中miR-200b，200c还可以用于预测卵巢肿瘤患者的生存率[39]；miR-18 a, miR-221, miR-2222，miR-224可以应用于肝肿瘤和肝硬化的诊断[40]；miR-29 a，miR-150可以判断非小细胞肺癌放疗的放射毒性的大小等[41]。

miRNAs不仅仅应用于上述疾病的诊断和治疗，在骨质疏松症的临床应用方面也有了初步的进展。Deng等发现在骨损伤的大鼠模型中，通过敲降miR-31可使得骨髓基质干细胞更多地向损伤部位迁移，行使其功能，有效地提高了骨损伤的修复[42]。2012年，Wang等挑选了20位绝经后白人女性，并将她们分为骨密度正常组和低骨密度组各10人，通过筛选365种miRNAs在其血液单核细胞中的表达情况，发现miR-133 a在低骨密度组中的水平明显高于正常骨密度组，认为其可能是一种有效的临床指标[43]。此后，Weilner等扩大了样本量，将近期伴有骨质疏松性骨折的患者和年龄相近的健康人的血清miRNA进行了筛选，发现了10个在两组人群中有显著差异的miRNAs，又在随后的体外实验中确认了et-7 g-5p, miR-10b-5p,miR-100-5p,miR-148 a-3p和miR-21-5p影响着成骨细胞的形成和功能，其中miR-148 a-3p和miR-21-5p也被认为和破骨细胞的活性有着密切关系[44]。

总的来说，目前已经有许多miRNA被认为可以作为更有效的临床指标，用于疾病的诊断、预后评估、了解肿瘤转移等，部分已经应用于临床，miRNA类的药物研究也在开展，说明进一步研究miRNA具有潜在的临床应用价值。

5 结语

骨质疏松症发病机制的研究日益深入，也面临许多难点，目前miRNA与骨质疏松症的研究成为近年来的新热点。大量研究证实多种miRNA对成骨细胞、破骨细胞的分化和功能活性起关键作用，直接或间接地影响着骨质疏松症发生、发展。因此，miRNA在骨质疏松症的精确诊断和精准治疗中有着重大意义。但体液中的miRNA与骨质疏松症之间的关系，以及如何有效地将miRNA作为靶点治疗骨质疏松症还有待进一步研究。